3.2.7. Kết quả tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 GmEXP1
Plasmid pCB301/GmEXP1 sau khi thiết kế thành công được biến
nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Đây là phương pháp biến nạp rất có hiệu quả, có thời gian thí nghiệm ngắn. Sản phẩm của quá trình biến nạp được ni chọn lọc trên mơi trường LB đặc có
~768bp 750bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chứa 50 mg/l kanamycin và 100 mg/l rifamycin, ủ petri đĩa ở 28oC trong thời gian 48 giờ.
Các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens được tạo ra nhờ xung điện chứa
Ti-plasmid tái tổ hợp đã được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (kanamycin 50 mg/l và 100 mg/l rifamycin). Chỉ có những khuẩn lạc A. tumefaciens được biến nạp thành công Plasmid pCB301/GmEXP1 mới sống được trên môi trường chọn lọc. Để kết luận chắc chắn những dòng khuẩn lạc trên mang vector chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR. Chọn ngẫu nhiên 6 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens mọc trên đĩa thạch để tiến hành phản ứng colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng được thực hiện với nhiệt độ gắn mồi 560C, lặp lại 30 chu kỳ. Sản phẩm phản ứng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong (Hình 3.14). Kết quả điện di cho thấy có 6/6 dịng khuẩn lạc được lựa chọn đều cho kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng PCR với 1 băng duy nhất có kích thước khoảng 768 bp. Với kết quả PCR đạt tỷ lệ 100%, có thể khẳng định chúng tôi đã biến nạp thành công vector pCB301/GmEXP1 vào vi khuẩn A. tumefaciens. Các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5, 6 trên có thể phục vụ cho việc chuyển gen vào thực vật.
~ 768bp 750bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR; Giếng 1-6: các dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1 kb khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1 kb
3.3. Kiểm tra hoạt động của vector mang cấu trúc GmEXP1 trên cây
thuốc lá mơ hình
3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc GmEXP1 vào cây thuốc lá
Sau khi biến nạp thành công vector vào vi khuẩn A. tumefaciens,
chúng tôi tiếp tục tiến hành chuyển gen GmEXP1 thông qua việc lây nhiễm chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 vào tế bào của các mảnh lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 đã được cắt tổn thương 4 cạnh và nuôi cấy trên môi trường cảm ứng GM trước 2 ngày.
Để chuẩn bị cho việc biến nạp chúng tôi đã song song với việc nuôi lỏng A. tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 đồng thời gây
tổn thương mảnh lá trước hai ngày. Sau hai ngày khuẩn được nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng khơng có kháng sinh, sau đó chúng tơi tiến hành đo OD nếu đạt chỉ số từ 0,6 đến 1 thì có thể sử dụng khuẩn để tiến hành biến nạp được.
Sau hai ngày đồng nuôi cấy trong tối (Hình 3.15.A), chúng tơi tiến hành rửa khuẩn bằng cefotaxim 500 mg/l, cấy chuyển các mảnh lá sang mơi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l và BAP 1 mg/l (Hình 3.15.B).
Sau 2-3 tuần xuất hiện các chồi nhỏ (Hình 3.15.C). Số mảnh lá sống sót trên mơi trường chọn lọc bằng kháng sinh là 125/150. Từ các mảnh lá, tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy lên môi trường MS cơ bản có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l để nhân nhanh chồi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau 4-5 tuần, chúng tôi thu được rất nhiều chồi từ các mảnh lá đã cảm ứng tạo mô sẹo, các chồi phát triển cao khoảng 3 cm thì được cắt và
chuyển sang mơi trường RM ( MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + IBA). RM
có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l (Hình 3.15.D).
Tỷ lệ chọn lọc sơ bộ của các mảnh lá trên môi trường chọn lọc qua 3 lần biến nạp được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen GmEXP1
Biến nạp Tổng mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 1 tuần Số mảnh lá sống sót sau 2 tuần Số mảnh lá sống sót sau 3 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trường chọn lọc Lần 1 50 46 43 40 40 30 Lần 2 50 45 42 39 37 32 Lần 3 50 43 40 38 31 30 Tổng 150 134 125 117 108 92
Bảng 3.1 cho thấy số lượng mảnh lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả năng những mảnh lá tồn tại và phát triển được là những mô mang các tế bào đã được chuyển gen. Sau 3 - 4 tuần, có 117/150 mảnh lá sống sót trên mơi trường chọn lọc qua 3 lần biến nạp. Sau 6 – 8 tuần, 92 cây thuốc lá chuyển gen hồn chỉnh được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạo thành (Hình 3.15.F). Hình 3.15 mơ tả tồn bộ quá trình chuyển gen tạo được cây thuốc lá mang cấu trúc gen GmEXP1.