GmEXP1; Giếng 1-4: các mẫu cDNA; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả thơi gel ở hình 3.2 cho thấy băng DNA có kích thước khoảng 0,77 kb, đủ độ sáng không lẫn tạp chất. Như vậy có thể nói đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 0,77 kb, đảm bảo sử dụng tốt cho phản ứng tiếp theo. ~ 0,77kb ~ 0,77kb 0,75k b 0,75kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm thơi gel đoạn mã hoá của gen
GmEXP1; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả tạo vector tái tổ hợp
Chúng tôi thực hiện phản ứng ghép nối (ligation) đoạn gen GmEXP1
vào vector tách dòng pBT, đây là vector có nhiều ưu điểm (kích thước nhỏ; có nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn; có chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản). Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen GmEXP1 vào vector pBT đã được mở vòng (Bảng 2.6)
được thực hiện trong ống eppendorf 0,5 ml sau đó để trong điều kiện 220
C với thời gian 3 giờ, kết quả đã tạo ra được vector tái tổ hợp
Kết quả tạo tế bào khả biến
Tế bào E.coli DH5α được cấy ra từ môi trường LB đặc nuôi qua đêm ở 370C. Chọn một khuẩn lạc muôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2 – 3 giờ. Đo OD600nm đạt 0,4 – 0,6 thì chuyển dịch sang ống ly tâm, để 15 phút trong đá. Ly tâm 4000v/p, ở 40C, trong 5 phút (lặp lại 3 lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ 3 để 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu, sau đó bổ sung 15 – 20% glycerol. Chia 50 µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml để bảo quản tế bào khả biến trong tủ - 850C.
Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt: bổ sung 5 µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗi hợp đặt trong đá 15 phút. Với nhiệt độ lạnh để mẫu trên đá và sau 30 phút đặt ngay hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ở 420C chính xác 1 phút 30 giây. Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá trong 5 phút. Bổ sung 500 µl mơi trường LB lỏng. Hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
200 v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải khử trùng trải 150 µl đến 250 µl dịch khuẩn lên đĩa mơi trường LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp ( pBT; X- gal: 30 µl; IPTG: 30 µl; carbenicillin: 30 µl; LB đặc: 25 µl). Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ. Sự có mặt của X-gal sẽ giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp. Trên mơi trường có mặt của carbenicillin, X-gal và IPTG, có thể phát triển hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng (Hình 3.3). Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin, nhưng chỉ khuẩn lạc màu trắng mới mang plasmid tái tổ hợp. Những vi khuẩn
E. coli DH5α chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacz hoàn chỉnh sẽ
tổng hợp ra -glactosidase. Enzyme này phân huỷ cơ chất X-gal có trong mơi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngồi mơi trường sẽ bị oxy hoá tạo thành màu xanh. Nếu gen ngoại lai xen vào giữa thì gen này sẽ bị phá hỏng, enzyme -glactosidase không được tạo ra, vì thế mặc dù có X- gal
trong mơi trường nhưng cơ chất này không bị thuỷ phân, không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có mầu trắng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tách dòng gen GmEXP1
Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn GmEXP1, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật colony- PCR, với cặp mồi đặc hiệu. Số lượng khuẩn lạc sau biến nạp rất lớn do đó chúng tơi tiến hành chọn ngẫu nhiên 9 khuẩn lạc trắng có kích thước đều nhau để thực hiện phản ứng colony- PCR. Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% thấy xuất hiện băng DNA mong muốn có kích thước khoảng 0,77 kb đã chứng tỏ plasmid mang đoạn gen GmEXP1 (Hình 3.4).
Các khuẩn lạc này được chọn dòng phục vụ cho việc đọc trình tự gen.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR; Giếng 1-9: các khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1kb lạc; M: thang chuẩn 1kb
Tiếp theo chúng tôi mang nuôi các khuẩn lạc đã được chọn lọc trong mơi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin ( tỉ lệ 1000LB: 1 carbenicillin). Nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ rồi mang tách plasmid. Sản phẩm tách plasmid được điện di kiểm tra trên gel agrose 0,8%, kết quả được thể hiện trên hình 3.5.
~0,77kb 1kb
0,75k b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp; Giếng 1-9: các dòng plasmid tái tổ hợp dòng plasmid tái tổ hợp
3.1.3. Kiểm tra plasmid trƣớc khi đọc trình tự
Để khẳng định chắc chắn plasmid mang gen đích, chúng tơi đã tiến hành kiểm tra sự có mặt của đoạn gen GmEXP1 bằng hai phương pháp là cắt bằng BamHI và PCR từ plasmid tái tổ hợp. Theo lý thuyết thì phản ứng cắt sẽ cho hai băng trong đó có một băng có kích thước khoảng 0,77 kb và một băng có kích thước khoảng 2,7 kb. Cịn trong sản phẩm PCR plasmid bằng cặp mồi pUC18 sẽ cho một băng duy nhất có kích thước khoảng gần 1 kb (Hình 3.6).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trƣớc khi đọc trình tự; Giếng 1-3: các dòng plasmid; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả hình ảnh điện di cả hai phản ứng kiểm tra đều cho kết quả mong muốn đúng theo lý thuyết, có thể kết luận mẫu plasmid đã đạt yêu cầu để gửi đi đọc trình tự.
3.1.4. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hố của gen GmEXP1
Để xác định trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 chúng tơi tiến
hành đọc trình tự 3 mẫu của cùng một plasmid mang gen đích. Kết quả đã xác định được trình tự gen có kích thước 768 nucleotid mã hoá cho 255 amino acid (Hình 3.7). Sau đó chúng tơi tiến hành so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 của SL1 với trình tự gen mang mã số AF516879 đã cơng bố trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Bioedit, kết quả được trình bày ở (Hình 3.7). ~0,77kb ~ 2,7kb 1kb 3kb 0,75k b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng SL1 và AF516879
Nhìn kết quả so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 giữa hai giống SL1 và trình tự mang mã số AF516879 ở (Hình 3.7) cho thấy chỉ có 2 vị trí khác nhau giữa hai trình tự xảy ra ở vị trí số 93 (trên trình tự của AF516879 là C cịn trên trình tự của SL1 là T) và ở vị trí 722 (trên trình tự của AF516879 là T cịn trên trình tự của SL1 là C). Như vậy mức độ tương đồng xác định được giữ hai giống đạt tới 99,7%
Tiếp theo chúng tôi tiếp tục so sánh protein suy diễn và kết quả thu được thể hiện ở (Hình 3.8).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein EXP1 giữa giống SL1 và AF516879
Kết quả so sánh trình tự amino acid cho thấy có sự thay đổi một amino acid ở vị trí số 241. Với kết quả này cho thấy sự tương đồng về amino acid lên đến 99,6% đây là chỉ số tương đồng rất cao giữa hai giống.
3.2. Kết quả thiết kế vector mang cấu trúc gen GmEXP1
3.2.1. Kết quả cắt plasmid pBT mang GmEXP1 bằng NotI và NcoI
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 4,5 µl; Buffer orange: 2,5 µl;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Khi vector pBT được xử lý bằng NotI và NcoI, vector pBT sẽ bị cắt
tại hai đầu của gen đích hình thành hai đầu dính khác nhau. Việc xử lý cắt bằng hai enzyme khác nhau có ý nghĩa trong việc ngăn cản sự đóng vịng trở lại của vector, Dự đoán về mặt lý thuyết, sản phẩm cắt của pBT bởi
NotI và NcoI khi chụp ảnh điện di sẽ có 2 băng tương ứng với kích thước
của vector pBT mở vịng khoảng 2705 bp và kích thước của gen GmEXP1
768 bp. Kết quả phản ứng cắt vector pBT bằng NotI và NcoI thể hiện trên
ảnh điện di.
Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1; M: thang chuẩn 1 kb
Kết quả ở (Hình 3.9) cho thấy xuất hiện 2 băng ở vị trí đúng với tính tốn lí thuyết, như vậy phản ứng cắt đã thành cơng. Với mục đích cắt lấy gen đích mang hai đầu dính khác nhau nên chúng tơi đã cắt băng có kích khoảng 768 bp để thôi gel tinh sạch bảo quản ở - 200C để dùng cho phản ứng tiếp sau.
~2,705kb
~0,77kb 2,5kb
0,75k b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.2. Kết quả cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3
Gắn được gen GmEXP1 vào plasmid pRTRA7/3 thì cần phải sử dụng
đầu nối bổ sung với hai đầu của đoạn gen GmEXP1 đã xử lý. Vì thế ta cần xử lý cắt mở vòng pRTRA7/3 tại hai điểm bằng hai enzyme là NotI và NcoI.
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 4,5 µl; Buffer orange: 2,5 µl; NotI: 1 µl; NcoI: 2 µl; pRTRA7/3: 15 µl. Ủ ở 370C/16 giờ. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0.8% (Hình 3.10). Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt sẽ cho băng lớn có kích thước khoảng 2,96 kb, còn băng nhỏ sẽ có kích thước khoảng 1,272 kb.
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng NotI + NcoI;
M: thang chuẩn 1kb
Hình 3.10 cho thấy phản ứng cắt khơng hồn tồn, nhưng độ sáng của băng DNA cần thu là đủ lượng để thôi gel. Chúng tôi tiến hành thu lượng plasmid pRTRA7/3 mở vịng tương ứng với băng có kích thước khoảng 2960
~2,96kb
~1,272kb 2,5kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bp được thể hiện trên ảnh điện di. Sản phẩm thôi gel được bảo quản ở - 200C để phục vụ cho phản ứng ghép nối ở giai đoạn tiếp theo.
3.2.3. Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1
Do pRTRA7/3 và GmEXP1 đề được xử lý bằng cùng một cặp enzyme
cắt là NotI và NcoI nên chúng hồn tồn có thể ghép nối lại với nhau. Theo
tính tốn lý thuyết thì đầu gen GmEXP1 bị cắt bởi enzyme NcoI sẽ gắn vào
đoạn CaMV35s của pRTRA7/3 và một đầu bị cắt bởi enzyme NotI sẽ gắn với đoạn c-myc-tag. Thành phần của phản ứng ghép nối này bao gồm: H2O: 2 µl; BufferT4 ligation: 2 µl; EgT4 ligation: 2 µl; pRTRA7/3: 4 µl; GmEXP1: 10
µl. Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 4 giờ.
Tiếp theo chúng tôi tiến hành nhân dòng pRTRA7/3 tái tổ hợp: thực hiện biến nạp pRTRA7/3 tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt; nuôi khuẩn trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc phù hợp. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ. Sau đó chú tơi qua sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc trên đĩa. Do đã có kháng sinh chọn lọc nên chỉ khuẩn nào mang plasmid pRTRA7/3 đã được gắn gen GmEXP1 thì mới có
khả năng sống sót và phát triển, con những khuẩn nào khơng mang plasmid pRTRA7/3 hay có nhưng plasmid pRTRA7/3 chưa đóng vịng thì cũng khơng khả năng sống. Thực tế cho thấy sự xuất hiện của nhiều khẩn lạc trên đĩa petri, qua đó có thể khẳng định q trình ghép nối giữa plasmid pRTRA7/3 mở vòng với gen GmEXP1 đã thành công. Từ những khẩn lạc đã chọn lọc
chúng tôi mang nuôi trên môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin (tỉ lệ 1ml LB/1 µl), đặt trên máy lắc 200 vịng/phút ở 370C trong 16 giờ. Sau đó chúng tơi tiến hành tách và tinh sạch plasmid theo quy trình, bảo quả ở nhiệt độ - 200C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.4. Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng HindIII
Thành phần phản ứng cắt gồm: H2O: 2 µl; Red Buffer: 3 µl; HindIII: 2 µl; pRTRA7/3: 23 µl. Ủ ở 370C trong 16 giờ. Kết quả cắt theo lý thuyết sẽ cho ra hai băng, một băng có kích thước khoảng 2,116 kb và một băng có kích thước 1,615 kb, kết quả được thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng HindIII; M:
thang chuẩn 1kb
Hình 3.11 thể hiện sản phẩm cắt chưa hồn tồn, cịn xuất hiện nhiều cấu trúc không gian khác nhau của plasmid. Sản phẩm cắt chưa hết nhưng cũng đã xuất hiện đoạn băng có kích thước mong muốn, đoạn gen cần thu
là đoạn có kích thước khoảng 1,615 kb. Với việc sử dụng enzyme HindIII
để cắt theo tính tốn thì đoạn cắt mong muốn sẽ có trình tự như sau: CaMV35s – gen đích (GmEXP1) – c-myc-tag – KDEL – polyA. Trong đó CaMV35s chính là promotor giúp GmEXP1 biểu hiện ở thực vật, c-myc-tag có vai trị trong việc kiểm tra biểu hiện gen trong cây chuyển gen, KDEL có vai trị trong q trình hồn chỉnh protein, polyA giúp cố định phân tử
~2,116kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mRNA. Sản phẩm cắt được thôi gel bảo quản ở nhiệt độ - 200C để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.5. Kết quả cắt plasmid pCB301 bằng HindIII
Thành phần của phản ứng cắt plasmid pCB301 gồm: H2O: 2 µl; Red Buffer: 3 µl; HindIII: 2 µl; plasmid pCB301 : 23 µl. Ủ ở 370C trong 16 giờ.
Với enzyme HindIII plasmid pCB301 sẽ bị cắt tại điểm 5295 và 5355 do đó
đoạn bị cắt bỏ sẽ có kích thước 60 bp và băng plasmid pCB301 mở vịng sẽ có kích thước là 5,502 kb. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.12).
Hình 3.12. Ảnh cắt pCB301 bằng HindIII; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả khơng thấy xuất hiện băng có kích thước 60 bp, ngun nhân là do có kích thước q nhỏ nên đã nhanh chóng di chuyển trong mơi trường thốt ra khỏi băng điện di. Kết quả hình ảnh cũng cho thấy đã xuất hiện đoạn băng mong muốn có kích thước khoảng 5,502 kb cịn có một băng lớn hơn 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kb, đây có là dạng siêu xoắn của plasmid do đó chúng di chuyển rất chậm trên gel agarose trong môi trường điện di. Chúng tôi tiến hành cắt băng mong muốn thôi gel tinh sạch, bảo quả ở nhiệt độ - 200C để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau này.
3.2.6. Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1
Plasmid pCB301 là một dạng Ti-plasmid trong Agrobacterium
tumefaciens đã được cải biến bằng cách loại bỏ đi gen gây độc và gắn vào gen
kháng sinh để chọn lọc để phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Cả hai cấu trúc là plasmid pCB301 và GmEXP1 đều được xử lý bằng cùng
một loại enzyme là HindIII, đo đó chúng dễ dàng có thể được ghép nối lại với