Biến nạp Tổng mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 1 tuần Số mảnh lá sống sót sau 2 tuần Số mảnh lá sống sót sau 3 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trường chọn lọc Lần 1 50 46 43 40 40 30 Lần 2 50 45 42 39 37 32 Lần 3 50 43 40 38 31 30 Tổng 150 134 125 117 108 92
Bảng 3.1 cho thấy số lượng mảnh lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả năng những mảnh lá tồn tại và phát triển được là những mô mang các tế bào đã được chuyển gen. Sau 3 - 4 tuần, có 117/150 mảnh lá sống sót trên mơi trường chọn lọc qua 3 lần biến nạp. Sau 6 – 8 tuần, 92 cây thuốc lá chuyển gen hồn chỉnh được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạo thành (Hình 3.15.F). Hình 3.15 mơ tả tồn bộ quá trình chuyển gen tạo được cây thuốc lá mang cấu trúc gen GmEXP1.
Hình 3.15. Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá
A: Mảnh lá sau khi nhiễm khuẩn được cấy trên môi trường GM
B: Mảnh lá được chuyển sang mơi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l.
C: Các cụm chồi được tạo thành sau hai tuần nuôi cấy trên mơi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l.
D: Các chồi màu xanh được tách ra trên môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50mg/l.
E: Chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l.
3.3.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá mang gen GmEXP1
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu lá của 22 cây thuốc lá chuyển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
gen GmEXP1 ngẫu nhiên. Kết quả tách DNA tổng số được thể hiện trong (Hình 3.16).
Hình 3.16. Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá; Giếng 1-22: các mẫu thuốc lá Giếng 1-22: các mẫu thuốc lá
Kết quả điện di (Hình 3.16) khẳng định các mẫu tách chiết DNA tổng số đều có thể sử dụng được cho phản ứng PCR.
Để kiểm tra sự có mặt của gen GmEXP1 trong cây, chúng tôi dùng
phương pháp PCR để nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng có nhiệt độ gắn mồi là 560C. Vì số bản sao gen trong lá cây thường ít hơn so với trong các mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR phải kéo dài hơn, trong thí nghiệm này chúng tơi cho lặp lại phản ứng 40 chu kỳ. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 3.17.
~ 768bp 750bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.17. Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá; Giếng 1-22: các mẫu thuốc lá; M: thang chuẩn 1 kb thuốc lá; Giếng 1-22: các mẫu thuốc lá; M: thang chuẩn 1 kb
Kết quả thể hiện ở (Hình 3.17) cho thấy, sản phẩm PCR khi điện di có 22/22 mẫu có sản phẩm PCR, kích thước khoảng 0,77 kb. Kích thước này hồn tồn phù hợp với chiều dài cấu trúc GmEXP1 của gen chuyển . Vì vậy,
có thể khẳng định gen GmEXP1 đã được chuyển vào cây thuốc lá. Như vậy,
bước đầu chúng tôi đã thu được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pCB301/GmEXP1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Đã phân lập được đoạn mã hoá của gen GmEXP1 có kích thước
768 bp từ mRNA và đoạn mã hố của gen GmEXP1 có sự sai khác ở 2 vị trí nucleotit so với trình tự của gen GmEXP1 mang mã số AF516879 đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế.
1.2. Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 và đã biến nạp vào chủng vi khuẩn A. Tumefaciens.
1.3. Đã tạo được cây thuốc lá mang gen GmEXP1 trong phòng thí
nghiệm bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium
tumefaciens.
2. Đề nghị
2.1. Tiếp tục phân tích, đánh giá khả năng phát triển của hệ rễ của các dòng thuốc lá chuyển gen.
2.2. Chuyển gen GmEXP1 vào một số giống đậu tương chịu hạn kém
hoặc có thể chuyển vào các loại cây trồng có rễ củ làm tăng kích thước rễ củ qua đó làm tăng giá trị kinh tế của các loại cây trồng này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu
ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen
của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam’’. Tạp chí Nơng nghiệp và Phát
triển nông thôn, 18, 11-16.
3. Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS
liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sỹ Di truyền học, Đại học Thái Ngun.
4. Trần Đình Long, Đồn Thanh Nhàn (1995). “Kết quả nghiên cứu giống đậu tương M103’. Kết quả nghiên cứu khoa học câu đậu đỗ 1991-1995: 52-56.
5. Trần Thị Phương Liên (2010) Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB Khoa hoc tự nhiên và Công nghệ: 82-140.
6. Chu Hoàng Mậu (2001), Nghiên sử dung phương pháp đột biến thực nghiêm để tạo dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học. Viện Công nghệ sinh
học, Hà Nội.
7. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng tế
bào chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu và ứng dụng. NXB Nơng nghiệp, Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tài liệu tiếng Anh
9. Ahn J.H., Choi Y., Kim S.G., Kwon Y.M., Choi Y.D., Lee J.S. (1998), “Expression of a Soybean Hydroxyproline-Rich Glycoprotein Gene Is Correlated with Maturation of Roots”, Plant Physiol, pp. 671 - 679. 10. Close T.J.(1997), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant
dehydrin proteins’’, Physiologia plantarum, 795-803.
11. Cosgrove D. J., Li Z. C., 1993. Role of expansin in cell enlargement of oat coleoptiles. Plant Physiol., 103: 1321-1328.
12. Cosgrove D. J., 1996. Plant cell enlargement and the action of expansin. BioEssays., 18: 533-540.
13. Cosgrove D. J., 1998. Cell wall loosening by expansin. Plant Physiol., 118: 333-339.
14. Cosgrove D. J., 1999. Enzymes and other agent that enhance cell wall extensibility. Annu Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50: 391-417. 15. Cosgrove D. J., 2000. Expansinve grouth of plant cell walls. Plant Physiol.
Biochem., 38: 109-124.
16. Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemienak D, and Slightom JL (1988), “Nuleotid sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers proline overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress’’. Gene. 64(2): 199-205.
17. Dix PJ, (1986) “Plant cell culture culture technology’’. Yeoman M.M (eds), Oxford, Blackwell Scientific Publications. 143-201.
18. HamiltonIIIEW,HeckathornSA (2001) MitochondrialadaptationstoNaCL. com plex I is protected by prolinee and small heat shock proteins, whereas
19. Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20. Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009) an auto phosphorylation site of the protein kinase SOS2 is important for salt telerance in Arabidopsis. Molecular Plant, doi: 10.1093/mp/ssn087.
21. Kam M.J., Yun H. S., Kanfman P. B., Chang S. C., Kim S. C., 2005. Two expansin, EXP1 and EXPB2, are correlated with the growth and develomet of maize root. J. Plant Physiol., 48(3): 304-310.
22. Kodym A, Afza R (2003) “Physical and chemical mutagenesis, plant functional genomics. Eric Grotewold(Ed.), Humana Press. 189-204. 23. Lee D.K., Ahn J.H., Song S.K., Choi Y.D., Lee J.S. (2003), “expression of
an expansin Gene Is Correlated with Root Elongation in Soybean”, Plant
Physiology, (131), pp. 985 - 997.
24. Li Y., Darley C.P., OngaroV., Fleming A., Schipper O., Baldauf S. L., McQueen-Mason S. J., 2000. Plant expansins are a Complex multigene family with an ancient eVolationary origin. J. Plant Physiol., 128(3): 854-864.
25. Nong V.H., Arahira M., Phan V.C., Kim C.S., Zhang D., Udaka K., Fukazawa C. (1997), “Glycine max cct - d gen (cDNA) for group II- chaperonin delta-subunit complete cds”, Genbank/EBI/DDBJ databases, Acc. No AB004233.
26. SabehatA, LurieS, WeissD (1998) Expression of small heat shock proteins at low temperatures. Plant Physiology, 177: 651-658.
27. Porcel R, azconR, Rui- Lozano JM (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycene max and Lactuca sativaplants”. Journal of Experimental Botany, 56(417): 1933-42.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28. Thomashow MF (1998) Role of cold responsive genes in plant freezing tolerance. Plant Physiology, 118: 1-7.
29. Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K,
Shinozaki K and Thomashow MF (2004) SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress- responsive gene expression in Arabidopsis thaliana. Proceeding of National Academy of Science, 101 (49): 17306-17311.
30. Vierling E, Kimpe JA (1992) Plant responses to environmental stress.
Current Opinion in Biotechnology, 3: 164-170.