STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ. Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của 10 ml dịch khuẩn.
Bổ sung 200 µl Sol I hịa tan tế bào hồn tồn. Bổ sung 400 µl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây. Bổ sung tiếp 300 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
Bổ sung 900 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng khơng cặn 900µl pha trên sang ống effendorf mới.
Cho 900 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -4o
C trong 30 – 180 phút, ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
Hịa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion. Bổ sung RNase
Ủ ở 370
C trong 30 phút.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.8. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide của gen
Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.2. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá
2.2.2.1. Quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens
Rửa Cuvette bằng cồn 700, rửa lại bằng nước khử ion vô trùng rồi sấy khô. Tế bào khả biến đặt trong nước đá ( khoảng 40C), 15 phút.
Bổ sung 1 µl plasmid vào 50 µl tế bào khả biến và trộn nhẹ.
Chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào Cuvette. Chỉnh thơng số máy xung điện: 2,5 kV, 25 µF, 200 Ω.
Tiến hành chạy xung điện.
Lấy Cuvete ra bổ sung 500 µl LB lỏng và mix nhẹ. Chuyển sang ống eppendoff 2 ml.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chuyển dịch ra đĩa môi trường LB đặc bổ sung 100 mg/l rifamycin, 50 mg/l kanamycin.
2.2.2.2. Phƣơng pháp tái sinh cây thuốc lá
Chuyển gen và tái sinh đa chồi: các mảnh lá được cắt với kích thước
khoảng 1cm2 và đặt trên môi trường cảm ứng tái sinh GM (MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + BAP 1mg/l). Sau hai ngày trên môi trường GM, mảnh lá sẽ được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm. Sau 30 phút, các mảnh lá tiếp tục được chuyển lên mơi trường GM (BAP 1ml/l) hai ngày. Sau đó, các mảnh lá tiếp tục được chuyển lên môi trường GM (BAP 1mg/l) . Sau 2 ngày các mảnh lá tiếp tục được chuyển lên mơi trường GM (BAP 1mg/l có chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin 1mg/l để tái sinh. Sau 4-5 tuần các cụm chồi hình thành tiếp tục được cắt chuyển lên môi trường GM (BAP 1mg/l) có kháng sinh.
Ra rễ: sau 4 tuần các chồi phát triển cao khoảng 3 cm thì được cắt và
chuyển sang môi trường RM ( MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l ) có kháng sinh chọn lọc.
2.2.2.3. Phƣơng pháp tách DNA từ cây thuốc lá
Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá cây thuốc lá:
Cân 200 g mẫu lá cây và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối, chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendoff 2 ml.
Bổ sung thêm 700 µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo nhẹ