dòng plasmid tái tổ hợp
3.1.3. Kiểm tra plasmid trƣớc khi đọc trình tự
Để khẳng định chắc chắn plasmid mang gen đích, chúng tơi đã tiến hành kiểm tra sự có mặt của đoạn gen GmEXP1 bằng hai phương pháp là cắt bằng BamHI và PCR từ plasmid tái tổ hợp. Theo lý thuyết thì phản ứng cắt sẽ cho hai băng trong đó có một băng có kích thước khoảng 0,77 kb và một băng có kích thước khoảng 2,7 kb. Cịn trong sản phẩm PCR plasmid bằng cặp mồi pUC18 sẽ cho một băng duy nhất có kích thước khoảng gần 1 kb (Hình 3.6).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trƣớc khi đọc trình tự; Giếng 1-3: các dịng plasmid; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả hình ảnh điện di cả hai phản ứng kiểm tra đều cho kết quả mong muốn đúng theo lý thuyết, có thể kết luận mẫu plasmid đã đạt yêu cầu để gửi đi đọc trình tự.
3.1.4. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hố của gen GmEXP1
Để xác định trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 chúng tôi tiến
hành đọc trình tự 3 mẫu của cùng một plasmid mang gen đích. Kết quả đã xác định được trình tự gen có kích thước 768 nucleotid mã hoá cho 255 amino acid (Hình 3.7). Sau đó chúng tơi tiến hành so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 của SL1 với trình tự gen mang mã số AF516879 đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Bioedit, kết quả được trình bày ở (Hình 3.7). ~0,77kb ~ 2,7kb 1kb 3kb 0,75k b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng SL1 và AF516879
Nhìn kết quả so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 giữa hai giống SL1 và trình tự mang mã số AF516879 ở (Hình 3.7) cho thấy chỉ có 2 vị trí khác nhau giữa hai trình tự xảy ra ở vị trí số 93 (trên trình tự của AF516879 là C cịn trên trình tự của SL1 là T) và ở vị trí 722 (trên trình tự của AF516879 là T cịn trên trình tự của SL1 là C). Như vậy mức độ tương đồng xác định được giữ hai giống đạt tới 99,7%
Tiếp theo chúng tôi tiếp tục so sánh protein suy diễn và kết quả thu được thể hiện ở (Hình 3.8).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein EXP1 giữa giống SL1 và AF516879
Kết quả so sánh trình tự amino acid cho thấy có sự thay đổi một amino acid ở vị trí số 241. Với kết quả này cho thấy sự tương đồng về amino acid lên đến 99,6% đây là chỉ số tương đồng rất cao giữa hai giống.
3.2. Kết quả thiết kế vector mang cấu trúc gen GmEXP1
3.2.1. Kết quả cắt plasmid pBT mang GmEXP1 bằng NotI và NcoI
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 4,5 µl; Buffer orange: 2,5 µl;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Khi vector pBT được xử lý bằng NotI và NcoI, vector pBT sẽ bị cắt
tại hai đầu của gen đích hình thành hai đầu dính khác nhau. Việc xử lý cắt bằng hai enzyme khác nhau có ý nghĩa trong việc ngăn cản sự đóng vịng trở lại của vector, Dự đoán về mặt lý thuyết, sản phẩm cắt của pBT bởi
NotI và NcoI khi chụp ảnh điện di sẽ có 2 băng tương ứng với kích thước
của vector pBT mở vịng khoảng 2705 bp và kích thước của gen GmEXP1
768 bp. Kết quả phản ứng cắt vector pBT bằng NotI và NcoI thể hiện trên
ảnh điện di.
Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1; M: thang chuẩn 1 kb
Kết quả ở (Hình 3.9) cho thấy xuất hiện 2 băng ở vị trí đúng với tính tốn lí thuyết, như vậy phản ứng cắt đã thành cơng. Với mục đích cắt lấy gen đích mang hai đầu dính khác nhau nên chúng tơi đã cắt băng có kích khoảng 768 bp để thơi gel tinh sạch bảo quản ở - 200C để dùng cho phản ứng tiếp sau.
~2,705kb
~0,77kb 2,5kb
0,75k b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.2. Kết quả cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3
Gắn được gen GmEXP1 vào plasmid pRTRA7/3 thì cần phải sử dụng
đầu nối bổ sung với hai đầu của đoạn gen GmEXP1 đã xử lý. Vì thế ta cần xử lý cắt mở vòng pRTRA7/3 tại hai điểm bằng hai enzyme là NotI và NcoI.
Thành phần của phản ứng cắt gồm: H2O: 4,5 µl; Buffer orange: 2,5 µl; NotI: 1 µl; NcoI: 2 µl; pRTRA7/3: 15 µl. Ủ ở 370C/16 giờ. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0.8% (Hình 3.10). Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt sẽ cho băng lớn có kích thước khoảng 2,96 kb, còn băng nhỏ sẽ có kích thước khoảng 1,272 kb.
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng NotI + NcoI;
M: thang chuẩn 1kb
Hình 3.10 cho thấy phản ứng cắt khơng hồn tồn, nhưng độ sáng của băng DNA cần thu là đủ lượng để thôi gel. Chúng tôi tiến hành thu lượng plasmid pRTRA7/3 mở vịng tương ứng với băng có kích thước khoảng 2960
~2,96kb
~1,272kb 2,5kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bp được thể hiện trên ảnh điện di. Sản phẩm thôi gel được bảo quản ở - 200C để phục vụ cho phản ứng ghép nối ở giai đoạn tiếp theo.
3.2.3. Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1
Do pRTRA7/3 và GmEXP1 đề được xử lý bằng cùng một cặp enzyme
cắt là NotI và NcoI nên chúng hồn tồn có thể ghép nối lại với nhau. Theo
tính tốn lý thuyết thì đầu gen GmEXP1 bị cắt bởi enzyme NcoI sẽ gắn vào
đoạn CaMV35s của pRTRA7/3 và một đầu bị cắt bởi enzyme NotI sẽ gắn với đoạn c-myc-tag. Thành phần của phản ứng ghép nối này bao gồm: H2O: 2 µl; BufferT4 ligation: 2 µl; EgT4 ligation: 2 µl; pRTRA7/3: 4 µl; GmEXP1: 10
µl. Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 4 giờ.
Tiếp theo chúng tôi tiến hành nhân dòng pRTRA7/3 tái tổ hợp: thực hiện biến nạp pRTRA7/3 tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt; nuôi khuẩn trên mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc phù hợp. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ. Sau đó chú tơi qua sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc trên đĩa. Do đã có kháng sinh chọn lọc nên chỉ khuẩn nào mang plasmid pRTRA7/3 đã được gắn gen GmEXP1 thì mới có
khả năng sống sót và phát triển, con những khuẩn nào không mang plasmid pRTRA7/3 hay có nhưng plasmid pRTRA7/3 chưa đóng vịng thì cũng khơng khả năng sống. Thực tế cho thấy sự xuất hiện của nhiều khẩn lạc trên đĩa petri, qua đó có thể khẳng định q trình ghép nối giữa plasmid pRTRA7/3 mở vòng với gen GmEXP1 đã thành công. Từ những khẩn lạc đã chọn lọc
chúng tôi mang nuôi trên môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin (tỉ lệ 1ml LB/1 µl), đặt trên máy lắc 200 vịng/phút ở 370C trong 16 giờ. Sau đó chúng tôi tiến hành tách và tinh sạch plasmid theo quy trình, bảo quả ở nhiệt độ - 200C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.4. Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng HindIII
Thành phần phản ứng cắt gồm: H2O: 2 µl; Red Buffer: 3 µl; HindIII: 2 µl; pRTRA7/3: 23 µl. Ủ ở 370C trong 16 giờ. Kết quả cắt theo lý thuyết sẽ cho ra hai băng, một băng có kích thước khoảng 2,116 kb và một băng có kích thước 1,615 kb, kết quả được thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng HindIII; M:
thang chuẩn 1kb
Hình 3.11 thể hiện sản phẩm cắt chưa hồn tồn, cịn xuất hiện nhiều cấu trúc không gian khác nhau của plasmid. Sản phẩm cắt chưa hết nhưng cũng đã xuất hiện đoạn băng có kích thước mong muốn, đoạn gen cần thu
là đoạn có kích thước khoảng 1,615 kb. Với việc sử dụng enzyme HindIII
để cắt theo tính tốn thì đoạn cắt mong muốn sẽ có trình tự như sau: CaMV35s – gen đích (GmEXP1) – c-myc-tag – KDEL – polyA. Trong đó CaMV35s chính là promotor giúp GmEXP1 biểu hiện ở thực vật, c-myc-tag có vai trị trong việc kiểm tra biểu hiện gen trong cây chuyển gen, KDEL có vai trị trong q trình hồn chỉnh protein, polyA giúp cố định phân tử
~2,116kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mRNA. Sản phẩm cắt được thôi gel bảo quản ở nhiệt độ - 200C để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.5. Kết quả cắt plasmid pCB301 bằng HindIII
Thành phần của phản ứng cắt plasmid pCB301 gồm: H2O: 2 µl; Red Buffer: 3 µl; HindIII: 2 µl; plasmid pCB301 : 23 µl. Ủ ở 370C trong 16 giờ.
Với enzyme HindIII plasmid pCB301 sẽ bị cắt tại điểm 5295 và 5355 do đó
đoạn bị cắt bỏ sẽ có kích thước 60 bp và băng plasmid pCB301 mở vịng sẽ có kích thước là 5,502 kb. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.12).
Hình 3.12. Ảnh cắt pCB301 bằng HindIII; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả khơng thấy xuất hiện băng có kích thước 60 bp, ngun nhân là do có kích thước q nhỏ nên đã nhanh chóng di chuyển trong mơi trường thốt ra khỏi băng điện di. Kết quả hình ảnh cũng cho thấy đã xuất hiện đoạn băng mong muốn có kích thước khoảng 5,502 kb cịn có một băng lớn hơn 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kb, đây có là dạng siêu xoắn của plasmid do đó chúng di chuyển rất chậm trên gel agarose trong môi trường điện di. Chúng tôi tiến hành cắt băng mong muốn thôi gel tinh sạch, bảo quả ở nhiệt độ - 200C để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau này.
3.2.6. Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1
Plasmid pCB301 là một dạng Ti-plasmid trong Agrobacterium
tumefaciens đã được cải biến bằng cách loại bỏ đi gen gây độc và gắn vào gen
kháng sinh để chọn lọc để phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Cả hai cấu trúc là plasmid pCB301 và GmEXP1 đều được xử lý bằng cùng
một loại enzyme là HindIII, đo đó chúng dễ dàng có thể được ghép nối lại với nhau nhờ enzyme T4 ligase. Thành phần của phản ứng ghép nối gồm: H2O: 2 µl; BufferT4: 2 µl; T4 ligase: 2 µl; GmEXP1: 6 µl; plasmid pCB301 : 8 µl. Phản ứng này được thực hiện ở 220C trong khoảng thời gian từ 3 giờ. Sau đó, chúng tơi tiến hành biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E. coli DH5α để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Kết quả biến nạp vào E. coli DH5α có nhiều khuẩn lạc sống sót được trên mơi trường có các kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chứng tỏ việc biến nạp trên đã thành công.
Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR
Chúng tôi tiến hành chọn 10 khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều, từ đĩa khuẩn trên để tiến hành tách plasmid, sau đó thực hiện phản ứng PCR plasmid với mồi đặc hiệu. Kết quả colony PCR kiểm tra bằng điện di trên gel agrose ở (Hình 3.13) cho thấy, 6/10 mẫu plasmid tách chiết từ E. coli
DH5α đã biến nạp vector tái tổ hợp pCB301/GmEXP1 cho kết quả dương tính, xuất hiện một băng vạch có kích thước khoảng 768 bp. Như vậy 6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mẫu plasmid mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 đều có thể sử dụng tốt cho thí nghiệm tiếp theo.
Từ các khuẩn lạc đã được kiểm tra dương tính, chúng tơi tiến hành nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, khuẩn được nuôi trên máy lắc 200 v/p ở nhiệt độ 370C trong thời gian 16 giờ. Sau 16 giờ tiến hành tách plasmid bảo quả ở - 200C để sử dụng biến nạp tiếp vào A. tumefaciens làm công cụ chuyển gen.
Hình 3.13. Hình điện di sản phẩm colony- PCR; Giếng 1-10: các dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1 kb khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1 kb
3.2.7. Kết quả tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 GmEXP1
Plasmid pCB301/GmEXP1 sau khi thiết kế thành công được biến
nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Đây là phương pháp biến nạp rất có hiệu quả, có thời gian thí nghiệm ngắn. Sản phẩm của quá trình biến nạp được ni chọn lọc trên môi trường LB đặc có
~768bp 750bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chứa 50 mg/l kanamycin và 100 mg/l rifamycin, ủ petri đĩa ở 28oC trong thời gian 48 giờ.
Các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens được tạo ra nhờ xung điện chứa
Ti-plasmid tái tổ hợp đã được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (kanamycin 50 mg/l và 100 mg/l rifamycin). Chỉ có những khuẩn lạc A. tumefaciens được biến nạp thành công Plasmid pCB301/GmEXP1 mới sống được trên môi trường chọn lọc. Để kết luận chắc chắn những dòng khuẩn lạc trên mang vector chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR. Chọn ngẫu nhiên 6 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens mọc trên đĩa thạch để tiến hành phản ứng colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng được thực hiện với nhiệt độ gắn mồi 560C, lặp lại 30 chu kỳ. Sản phẩm phản ứng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong (Hình 3.14). Kết quả điện di cho thấy có 6/6 dịng khuẩn lạc được lựa chọn đều cho kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng PCR với 1 băng duy nhất có kích thước khoảng 768 bp. Với kết quả PCR đạt tỷ lệ 100%, có thể khẳng định chúng tôi đã biến nạp thành công vector pCB301/GmEXP1 vào vi khuẩn A. tumefaciens. Các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5, 6 trên có thể phục vụ cho việc chuyển gen vào thực vật.
~ 768bp 750bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR; Giếng 1-6: các dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1 kb khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1 kb
3.3. Kiểm tra hoạt động của vector mang cấu trúc GmEXP1 trên cây
thuốc lá mơ hình
3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc GmEXP1 vào cây thuốc lá
Sau khi biến nạp thành công vector vào vi khuẩn A. tumefaciens,
chúng tôi tiếp tục tiến hành chuyển gen GmEXP1 thông qua việc lây nhiễm chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 vào tế bào của các mảnh lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 đã được cắt tổn thương 4 cạnh và nuôi cấy trên môi trường cảm ứng GM trước 2 ngày.
Để chuẩn bị cho việc biến nạp chúng tôi đã song song với việc nuôi lỏng A. tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 đồng thời gây
tổn thương mảnh lá trước hai ngày. Sau hai ngày khuẩn được nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng khơng có kháng sinh, sau đó chúng tơi tiến hành đo OD nếu đạt chỉ số từ 0,6 đến 1 thì có thể sử dụng khuẩn để tiến hành biến nạp được.
Sau hai ngày đồng nuôi cấy trong tối (Hình 3.15.A), chúng tơi tiến hành rửa khuẩn bằng cefotaxim 500 mg/l, cấy chuyển các mảnh lá sang mơi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l và BAP 1 mg/l (Hình 3.15.B).
Sau 2-3 tuần xuất hiện các chồi nhỏ (Hình 3.15.C). Số mảnh lá sống sót trên mơi trường chọn lọc bằng kháng sinh là 125/150. Từ các mảnh lá, tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy lên môi trường MS cơ bản có bổ sung