Hình 3.12. Ảnh cắt pCB301 bằng HindIII; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả khơng thấy xuất hiện băng có kích thước 60 bp, ngun nhân là do có kích thước q nhỏ nên đã nhanh chóng di chuyển trong mơi trường thốt ra khỏi băng điện di. Kết quả hình ảnh cũng cho thấy đã xuất hiện đoạn băng mong muốn có kích thước khoảng 5,502 kb cịn có một băng lớn hơn 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kb, đây có là dạng siêu xoắn của plasmid do đó chúng di chuyển rất chậm trên gel agarose trong môi trường điện di. Chúng tôi tiến hành cắt băng mong muốn thôi gel tinh sạch, bảo quả ở nhiệt độ - 200C để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau này.
3.2.6. Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1
Plasmid pCB301 là một dạng Ti-plasmid trong Agrobacterium
tumefaciens đã được cải biến bằng cách loại bỏ đi gen gây độc và gắn vào gen
kháng sinh để chọn lọc để phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Cả hai cấu trúc là plasmid pCB301 và GmEXP1 đều được xử lý bằng cùng
một loại enzyme là HindIII, đo đó chúng dễ dàng có thể được ghép nối lại với nhau nhờ enzyme T4 ligase. Thành phần của phản ứng ghép nối gồm: H2O: 2 µl; BufferT4: 2 µl; T4 ligase: 2 µl; GmEXP1: 6 µl; plasmid pCB301 : 8 µl. Phản ứng này được thực hiện ở 220C trong khoảng thời gian từ 3 giờ. Sau đó, chúng tơi tiến hành biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E. coli DH5α để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Kết quả biến nạp vào E. coli DH5α có nhiều khuẩn lạc sống sót được trên mơi trường có các kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chứng tỏ việc biến nạp trên đã thành công.
Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR
Chúng tôi tiến hành chọn 10 khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều, từ đĩa khuẩn trên để tiến hành tách plasmid, sau đó thực hiện phản ứng PCR plasmid với mồi đặc hiệu. Kết quả colony PCR kiểm tra bằng điện di trên gel agrose ở (Hình 3.13) cho thấy, 6/10 mẫu plasmid tách chiết từ E. coli
DH5α đã biến nạp vector tái tổ hợp pCB301/GmEXP1 cho kết quả dương tính, xuất hiện một băng vạch có kích thước khoảng 768 bp. Như vậy 6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mẫu plasmid mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 đều có thể sử dụng tốt cho thí nghiệm tiếp theo.
Từ các khuẩn lạc đã được kiểm tra dương tính, chúng tơi tiến hành ni trong mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, khuẩn được nuôi trên máy lắc 200 v/p ở nhiệt độ 370C trong thời gian 16 giờ. Sau 16 giờ tiến hành tách plasmid bảo quả ở - 200C để sử dụng biến nạp tiếp vào A. tumefaciens làm công cụ chuyển gen.
Hình 3.13. Hình điện di sản phẩm colony- PCR; Giếng 1-10: các dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1 kb