M: thang chuẩn 1kb
Hình 3.10 cho thấy phản ứng cắt khơng hồn tồn, nhưng độ sáng của băng DNA cần thu là đủ lượng để thôi gel. Chúng tôi tiến hành thu lượng plasmid pRTRA7/3 mở vịng tương ứng với băng có kích thước khoảng 2960
~2,96kb
~1,272kb 2,5kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bp được thể hiện trên ảnh điện di. Sản phẩm thôi gel được bảo quản ở - 200C để phục vụ cho phản ứng ghép nối ở giai đoạn tiếp theo.
3.2.3. Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1
Do pRTRA7/3 và GmEXP1 đề được xử lý bằng cùng một cặp enzyme
cắt là NotI và NcoI nên chúng hồn tồn có thể ghép nối lại với nhau. Theo
tính tốn lý thuyết thì đầu gen GmEXP1 bị cắt bởi enzyme NcoI sẽ gắn vào
đoạn CaMV35s của pRTRA7/3 và một đầu bị cắt bởi enzyme NotI sẽ gắn với đoạn c-myc-tag. Thành phần của phản ứng ghép nối này bao gồm: H2O: 2 µl; BufferT4 ligation: 2 µl; EgT4 ligation: 2 µl; pRTRA7/3: 4 µl; GmEXP1: 10
µl. Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 4 giờ.
Tiếp theo chúng tôi tiến hành nhân dòng pRTRA7/3 tái tổ hợp: thực hiện biến nạp pRTRA7/3 tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt; nuôi khuẩn trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc phù hợp. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ. Sau đó chú tơi qua sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc trên đĩa. Do đã có kháng sinh chọn lọc nên chỉ khuẩn nào mang plasmid pRTRA7/3 đã được gắn gen GmEXP1 thì mới có
khả năng sống sót và phát triển, con những khuẩn nào khơng mang plasmid pRTRA7/3 hay có nhưng plasmid pRTRA7/3 chưa đóng vịng thì cũng khơng khả năng sống. Thực tế cho thấy sự xuất hiện của nhiều khẩn lạc trên đĩa petri, qua đó có thể khẳng định q trình ghép nối giữa plasmid pRTRA7/3 mở vòng với gen GmEXP1 đã thành công. Từ những khẩn lạc đã chọn lọc
chúng tôi mang nuôi trên môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin (tỉ lệ 1ml LB/1 µl), đặt trên máy lắc 200 vịng/phút ở 370C trong 16 giờ. Sau đó chúng tơi tiến hành tách và tinh sạch plasmid theo quy trình, bảo quả ở nhiệt độ - 200C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.4. Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng HindIII
Thành phần phản ứng cắt gồm: H2O: 2 µl; Red Buffer: 3 µl; HindIII: 2 µl; pRTRA7/3: 23 µl. Ủ ở 370C trong 16 giờ. Kết quả cắt theo lý thuyết sẽ cho ra hai băng, một băng có kích thước khoảng 2,116 kb và một băng có kích thước 1,615 kb, kết quả được thể hiện trên hình 3.11.