2.2.2. Phƣơng pháp xác định các thông số trong nƣớc thải [4, 23]
Các chỉ tiêu: pH, nhiệt độ của nƣớc thải đƣợc đo bằng máy đo hiện trƣờng; thông số Xyanua (CN-) đƣợc xác đinh bằng phƣơng pháp chuẩn độ iot [4]; các thông số COD, BOD5, T-N, T-P, Tổng cacbon, Amon (NH4
+
), kim loại (Al, Ca, Cd,...) đƣợc xác định theo phƣơng pháp trong Standard Method hoặc theo tiêu chuẩn phân tích trong nƣớc hiện hành.
2.2.3. Phƣơng pháp khử xyanua (CN-) có trong nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn [4]
Có rất nhiều biện pháp khử xyanua trong nƣớc nhƣ xục khí CO2, oxy hóa bằng Clo, bằng KmnO4,… tuy nhiên sử dụng Ozon khử xyanua đơn giản và hiệu quả hơn rất nhiều. Nguyên lý của biện pháp khử xyanua bằng ozon (O3):
Tác nhân này ít độc hại hơn clo, thực hiện đơn giản hơn và oxy hoá CN - triệt để thành chất không độc.
CN - + O3 → OCN - + O2
6OCN - + 8O3 → 6CO2 + 3N2 + 902
Bên cạnh đó, O3 có thể oxy hoá đƣợc phức xyano của sắt rất bền và xyanua hữu cơ
2.2.4. Phƣơng pháp xác định nồng độ delta-endotoxin trong dịch nuôi cấy
Delta-endotoxin đƣợc xác định trên cơ sở hòa tan tinh thể protein độc trong môi trƣờng kiềm: 1ml mẫu dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm 10000g trong 10 phút ở 4oC. Phần cặn bao gồm bào tử, tinh thể protein độc, mảnh vụn tế bào và phần rắn lơ lửng còn lại đƣợc sử dụng để xác định nồng độ tinh thể protein độc hòa tan (δ-protein). Phần cặn đƣợc rửa 3 lần, mỗi lần bằng 1ml 0,14M NaCl-0,01% Triton X – 100. Việc rửa này giúp loại bỏ các protein và các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 39 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
protease còn bám vào phần cặn. Phần cặn đã rửa chứa tinh thể protein đƣợc thủy phân trong dung dịch NaOH 0,05N (pH 12,5) trong 3h ở 30oC trong điều kiện có khuấy. Dịch huyền phù sau đó đƣợc ly tâm ở 10000g trong 10 phút ở 4oC, phần cặn sau khi ly tâm sẽ đƣợc loại bỏ còn phần dịch nổi sẽ đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng delta-endotoxin theo phƣơng pháp Bradford sử dụng BSA làm chất chuẩn [7].
Đƣờng chuẩn protein:
Chất chuẩn BSA đƣợc pha từ dung dịch mẹ (1000mg/l) và pha loãng ở các nồng độ sau:
TT 1 2 3 4 5 6
Nồng độ BSA (mg/l) 100 200 400 600 800 1000 Mẫu xác định theo phƣơng pháp Bradford, đƣờng chuẩn thu đƣợc đƣợc thể hiện ở hình 2: y = 1357.2x - 79.932 R2 = 0.9964 0 200 400 600 800 1000 1200 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Abs N ồn g độ ( m g/ l)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 40 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
2.2.5. Đánh giá khả năng phát triển của Bt trên môi trƣờng nƣớc thải chế biến tinh bột đã qua tiền xử lý biến tinh bột đã qua tiền xử lý
Nƣớc thải sản xuất tinh bột sau khi đã qua tiền xử lý xyanua đƣợc chuẩn về pH 7 và pha loãng với nƣớc máy với tỷ lệ nhƣ sau:
Nƣớc thải tinh bột sắn (%) Nƣớc máy (%)
10 90
50 50
100 0
Dung dịch môi trƣờng sau khi pha đƣợc chia vào bình tam giác theo tỷ lệ 20% thể tích bình sau đó đem khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Chủng giống sau khi đã hoạt hóa (từ chủng giống Bacillus thuringiensis hoạt hóa trên môi trƣờng TSB ở 30o
C, 200 vòng/phút trong 12h) đƣợc cấy vào bình thí nghiệm trên với tỷ lệ 2% về thể tích với đối chứng là môi trƣờng TSB. Đem nuôi trong ở điều kiện 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Lấy mẫu tại thời điểm ban đầu (0 giờ) để xác định mật độ tế bào và bào tử. Lấy mẫu tại thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy để xác định mật độ tế bào, mật độ bào tử, hàm lƣợng δ-endotoxin.
2.2.6. Nghiên cứu tiền xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn
Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TN1: Nƣớc thải tinh bột sắn chỉnh pH 7, đem khử trùng 121o
C trong 15 phút. TN2: Nƣớc thải chế biến tinh bột sắn đƣợc sục khí ozon trong 30 phút sau đó đƣợc chỉnh về pH 7, sau đó đƣợc đem khử trùng ở 121o
C trong 15 phút.
Bình thí nghiệm đƣợc cấy 2% dịch giống và đem nuôi lắc trong 24 giở điều kiện nhiệt độ 30oC, 200rpm. Sau đó đƣợc đem xác định mật độ tế bào và mật độ bào tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 41 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
2.2.7. Đánh giá ảnh hƣởng pH lên khả năng sinh trƣởng của Bt
Nƣớc thải tinh bột đƣợc chia vào các bình tam giác theo tỷ lệ 20% thể tích bình và đƣợc chuẩn về pH: 5, 6, 7, 8 bằng NaOH 10M sau đó đem khử trung ở 121oC trong 15 phút để đánh giá khả năng phát triển và sinh độc tố của Bt. Cấy chủng giống sau khi đã hoạt hóa (từ chủng giống Bacillus thuringiensis hoạt hóa trên môi trƣờng TSB ở 30oC, 200 vòng/phút trong 12h) đƣợc cấy vào bình thí nghiệm trên với tỷ lệ 2% về thể tích, đem nuôi trong ở điều kiện 30o
C, tốc độ lắc 200 vòng/phút cùng với đối chứng là môi trƣờng TSB. Lấy mẫu tại thời điểm 0h để xác định mật độ tế bào. Lấy mẫu tại thời điểm 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h để xác định mật độ tế bào, mật độ bào tử và hàm lƣợng δ-endotoxin.
2.2.8. Ảnh hƣởng của độ thoáng khí đến sinh trƣởng và sinh độc tính của
Bacillus thuringiensis
Để nghiên cứu ảnh hƣởng của độ thoáng khí tiến hành thí nghiệm nhƣ sau:
- Chuẩn bị môi trƣờng nƣớc thải sản xuất tinh bột, chuẩn pH về 7. Dịch môi trƣờng đƣợc chia vào các bình với tỷ lệ khác nhau theo các phƣơng án thí nghiệm sau:
TN1: lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 20% thể tích bình TN2: lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 30% thể tích bình TN3: lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 40% thể tích bình TN4: lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 50% thể tích bình
Các bình thí nghiệm đƣợc nuôi cấy ở điều kiện 200 vòng/phút, 30oC. Mẫu thí nghiệm đƣợc lấy ở 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ để xác định mật độ tế bào, mật độ bào tử, lƣợng delta-endotoxin sản sinh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 42 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
2.2.9. Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện cấp khí của quá trình lên men trong hệ thống lên men quy mô phòng thí nghiệm (thể tích 5L) trên nƣớc trong hệ thống lên men quy mô phòng thí nghiệm (thể tích 5L) trên nƣớc thải tinh bột lên sự sinh trƣởng và phát triển của Bt
2.2.9.1. Đánh giá ảnh hƣởng của tốc độ khuấy
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong hệ lên men có thể tích 5L với thể tích môi trƣờng nƣớc thải tinh bột sử dụng là 3L, tốc độ thổi khí 0,5vvm, pH 7, nhiệt độ lên men 30oC. Thời gian lên men đƣợc kéo dài trong 72 giờ nhằm tạo điều kiện cho mật độ tế bào tiến tới pha ổn định. Tốc độ khuấy của hệ thống đƣợc thay đổi từ 150 đến 550 rpm để tạo điều kiện khuấy trộn nhƣ yêu cầu thí nghiệm. Các thông số môi trƣờng đƣợc theo dõi thông qua chƣơng trình giám sát của hệ thống lên men. Mẫu đƣợc lấy tại thời điểm ban đầu (0 giờ), 12, 24, 36, 48 giờ và đem xác định mật độ tế bào và bào tử, hàm lƣợng delta- endotoxin.
2.2.9.2. Đánh giá ảnh hƣởng tốc độ thổi khí
Sau khi xác định đƣợc tốc độ khuấy trộn tối ứu, tiến hành xác định tốc độ thổi khí phù hợp cho sự sinh trƣởng của Bt trong hệ lên men với điều kiện tƣơng tự thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng tốc độ khuấy, tuy nhiên tốc độ thổi khí đƣợc thay đổi từ 0,1 đến 1 vvm. Các thông số giám sát đƣợc theo dõi thông qua chƣơng trình giám sát. Mẫu đƣợc lấy tại thời điểm ban đầu (0 giờ), 12, 24, 36, 48 giờ và đem xác định mật độ tế bào và bào tử.
2.2.10. Đánh giá biến động của pH trong quá trình lên men, so sánh quá trình lên men có khống chế ổn định pH và không ổn định pH trình lên men có khống chế ổn định pH và không ổn định pH
Quá trình lên men đƣợc tiến hành với nƣớc thải tinh bột đƣợc điều chỉnh pH 7 và loại bỏ xyanua. Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo 2 phƣơng án:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 43 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
Phƣơng án 1: Không điều chỉnh pH – môi trƣờng nƣớc thải tinh bột đƣợc đƣa về pH 7 trƣớc khi tiến hành khử trùng. Trong quá trình lên men không điều khiển pH. pH trong suốt quá trình thí nghiệm đƣợc thống kê lại.
Phƣơng án 2: Điều chỉnh pH – nƣớc thải sử dụng cũng đƣợc đƣa về pH 7 và trong quá trình lên men có điều khiển ổn định pH luôn giữ trong khoảng trung tính (7).
Ở cả hai phƣơng án thí nghiệm, lấy mẫu tại các thời điểm 0, 12, 24, 36, 48 giờ để xác định mật độ tế bào, mật độ bào tử, hàm lƣợng delta-endotoxin tạo thành.
2.2.11. Lên men Bt trong hệ lên men quy mô phòng thí nghiệm, đánh giá hiệu quả giệt sâu của sản phẩm lên men và so sánh với chế phẩm thƣơng hiệu quả giệt sâu của sản phẩm lên men và so sánh với chế phẩm thƣơng mại hiện có trên thị trƣờng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong bình lên men có thể tích 5L (thể tích làm việc thực tế 3L), với nhƣng điều kiện môi trƣờng (pH, tốc độ thổi khí, tốc độ khuấy trộn, điều kiện pH) đƣợc tối ƣu hóa từ những thí nghiệm ở trên.
- Mẫu đƣợc lấy định kỳ 2h một lần để phân tích mật độ tế bào, mật độ bào tử, nồng độ delta-endotoxin, kết thúc thí nghiệm sau 48h nuôi.
Dịch sản phẩm lên men đƣợc đem tiến hành thử nghiệm sinh học theo phƣơng pháp đƣớc trình bày ở phần 2.2.12 và so sánh với sản phẩm thƣơng phẩm có tính chất tƣơng tự hiện có trên thị trƣờng theo bố trí thí nghiệm nhƣ sau: Dịch sản phẩm lên men và chế phẩm V-Bt do công ty Hainan Nature Bio – Technology sản xuất, đƣợc pha loãng theo các nồng độ 1, 2, 5 10% (nồng độ 10% theo hƣớng dẫn sử dụng của chế phẩm V-Bt).
2.2.12. Phƣơng pháp thử nghiệm sinh học
Tiến hành theo phƣơng pháp của S.H.Park [21]: Thử nghiệm độc tính sinh học của Bacillus thuringiensis đƣợc tiến hành trên sâu đục thân ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 44 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
(Ostrinia furnacalis) ở độ tuổi 2. Ở mỗi phƣơng án thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: 100 g thức ăn đƣợc bổ sung dịch nuôi cấy Bt, sau đó bổ sung thêm 100 con sâu và dịch nuôi cấy với nồng độ cần thiết. Sau mỗi ngày, kiểm tra số lƣợng sâu chết và thí nghiệm đƣợc kéo dài 7 ngày.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát tính chất của nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn
Nƣớc thải tinh bột sắn đƣợc thu từ ống nƣớc thải từ phân xƣởng tinh bột thuộc xƣởng sản xuất tinh bột tại Tiên Sơn - Bắc Ninh. Kết quả phân tích đƣợc thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phân tích chất lƣợng nƣớc thải sản xuất tinh bột tại xƣởng sản xuất tinh bột Tiên Sơn – Bắc Ninh.
TT Chỉ tiêu Đơn vị tính Giá trị
1 pH - 3,82 2 Nhiệt độ o C 28-30 3 COD mg/l 11300 4 BOD5 mg/l 7500 5 Cặn lơ lửng (SS) mg/l 2300 6 Amon (NH4 + ) mg/l 45 7 Tổng cacbon g/l 5,76
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 45 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
8 T-N mg/l 150,87 9 T-P mg/l 287,32 10 Xyanua (CN-) mg/l 0,156 11 Al mg/l 3,021 12 Ca mg/l 1,7 13 Cd mg/l 0,002 14 Cr mg/l 0,036 15 Cu mg/l 0,3371 16 Fe mg/l 0,525 17 K mg/l 1,05 18 Mg mg/l 2,0355 19 Mn mg/l 0,615 20 Na mg/l 11,205 21 Ni mg/l 0,0368 22 Pb mg/l 0,0192 23 S mg/l 0,8205 24 Zn mg/l 1,0178 Nhận xét:
Qua kết quả phân tích thành phần nƣớc thải của quá trình sản xuất tinh bột sắn ta có thể thấy rằng:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 46 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
-Nƣớc thải từ quá trình sản xuất tinh bột sắn có pH rất thấp (3,82), đặc biệt COD, BOD5 của đối tƣợng nƣớc thải này là rất cao (lần lƣợt là: 11300 mg/l và 7500 mg/l) và cao gấp hàng trăm lần nếu đem so sánh với QCVN 24:2009/BTNMT. Bên cạnh đó, nƣớc thải sản xuất tinh bột có Tổng cacbon, T-N, T-P rất cao (với Tổng cacbon lên tới 5,67 g/l, T-N là 150,87 mg/l, T-P là 287,32 mg/l (theo QCVN 24 (B) giới hạn cho phép xả ra môi trƣờng của hai chỉ tiêu T-N và T-P lần lƣợt là: 30 và 6 mg/l)).
-Kết quả phân tích cũng cho thấy, hàm lƣợng cặn lơ lửng (SS) cao gấp 23 lần chuẩn thải, cũng phải kể đến hàm lƣợng xyanua có trong nƣớc thải cũng khá cao và vƣợt chuẩn thải của QCVN 24 (B) tới 1,56 lần. Có thể thấy rằng, đây sẽ là nguồn ô nhiễm hết sức lớn nếu nhƣ chúng không đƣợc xử lý mà bị thải thẳng ra môi trƣờng.
-Tuy nhiên, ta có thể thấy rằng nƣớc thải chế biến tinh bột có tỷ lệ BOD/COD là khoảng 0,66, theo nhiều tài liệu cũng nhƣ các nghiên cứu trƣớc đó chỉ ra rằng vi sinh vật có thể phát triển đƣợc do có hàm lƣợng chất hƣu cơ cao. Hàm lƣợng nitơ, photpho có trong nƣớc thải cũng khá cao có thể đáp ứng nhƣ cầu chất dinh dƣỡng cho sự phát triển của vi sinh vật. Bên cạnh đó từ kết quả phân tích thành phần nƣớc thải sản xuất tinh bột từ sắn, chúng tôi nhận thấy rằng do đặc thù của công nghệ sản xuất cũng nhƣ đối tƣợng sử dụng là củ sắn nên trong thành phần nƣớc thải chỉ có lƣợng rất nhỏ kim loại nói chung và kim loại nặng nói riêng. Một số công trình nghiên cứu trƣớc đó đã sử dụng nƣớc thải của nhà mày tinh bột mỳ nhƣ nguồn cơ chất để nuôi cấy Bt đã cho nhƣng kết quả rất khả quan nhƣ ở nghiên cứu của Yezza thực hiện năm 2006
Nhƣ vậy, nƣớc thải của ngành sản xuất tinh bột sắn là một nguồn gây ô nhiễm môi trƣờng trầm trọng nếu không đƣợc xử lý phù hợp, tuy nhiên đây cũng sẽ là một nguồn dinh dƣỡng rất tốt cho vi sinh vật nếu chúng ta có thể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Häc viªn: TrÇn Hµ Ninh 47 Chuyªn ngµnh: Vi sinh vËt
tận dụng đƣợc tối đa các chất dinh dƣỡng có trong nƣớc thải và loại bỏ các chất độc hại (nhƣ xyanua,…) ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi sinh vật.
3.2. Thử nghiệm khả năng phát triển của Bt trên nƣớc thải tinh bột sắn
Kết quả thử nghiệm khả năng sinh trƣởng và phát triển của Bt trên môi trƣờng nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thử nghiệm khả năng phát triển của Bt trên nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn
Thời gian nuôi (h) Mật độ tổng số (cfu/ml) Mật độ bào tử (cfu/ml) delta-endotoxin (mg/l) 0 6,50.104 2,60.103 12 4,81.104 4,80.104 187,96 24 - 5,70.104 145,93 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi chú: “tổng số - tế bào và bào tử” Nhận xét:
Sau 12 giờ nuôi cấy, mật độ tổng số giảm mạnh, sau 24 giờ không phát hiện thấy tế bào sinh dƣỡng. Hiện tƣợng trên có thể do việc thay đổi điều kiện nuôi cấy đột ngột từ môi trƣờng tối ƣu của Bt sang môi trƣờng nƣớc thải tinh