Sau thời gian lên men trong môi trường nuôi cấy, thu dịch chiết thô bằng cách ly tâm dịch môi trường 6000 vòng/5 phút, loại bỏ sinh khối, dịch thu được đem lọc qua giấy lọc. Ta thu được dịch enzyme thô.
Ghi chú: Để hoạt độ enzyme ít bị mất đi trong quá trình ly tâm, thì trước khi ly tâm nên cho các bình erlen chứa dịch lên men vào trong tủ lạnh.
2.3.4 Xác định hoạt độ phytase của các chủng nấm men có vòng phân giải lớn - chọn chủng nấm men có hoạt độ phytase cao nhất
Nuôi tăng sinh các chủng nấm men trong môi trường môi trường
Schopfer (Na-phytate 0,1% )ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Dùng pipetman hút 1ml môi trường tăng sinh cho vào erlen chứa 100ml môi trường YPD 0,5% Na-phytate, lên men nuôi cấy lắc trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng, kết thúc lên men thu mẫu, ly tâm 6000 vòng/5 phút, lọc thu dịch trong đem xác định hoạt độ phytase.
2.3.5 Chọn lọc môi trường thích hợp cho nấm men sinh phytase
cao nhất
Chọn ra chủng có hoạt độ phytase cao nhất để khảo sát môi trường lên men thích hợp cho nấm men.
Tăng sinh chủng có hoạt độ phytase cao nhất trong môi trường Schopfer (Na-phytate 0,1% ) ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Dùng pipetman hút 1ml môi trường tăng sinh lần lượt cho vào các môi trường lên men bột bắp (BB), YPD Na-phytate 0,5%. Lên men nuôi cấy lắc 5 ngày ở nhiệt độ phòng, kết thúc lên men thu mẫu, ly tâm 6000 vòng/5 phút, lọc thu dịch trong đem xác định hoạt độ phytase.
2.3.6 Khảo sát thời gian nuôi cấy
Sau khi chọn được môi trường lên men thích hợp, tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy liên tục trong 5 ngày, cứ 24 giờ thu mẫu, ly tâm 6000 vòng/5 phút, lọc thu dịch trong đem xác định hoạt độ phytase.
2.3.7 Khảo sát tỉ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men sinh phytase
Tăng sinh chủng nấm men trong môi trường Schopfer Na-phytate 0,1% ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Bổ sung vào các bình erlen chứa 100ml môi trường các tỉ lệ giống 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%. Cho lên men nuôi cấy lắc trong 5 ngày, kết thúc lên men thu mẫu, ly tâm 6000 vòng/5 phút, lọc thu dịch trong đem xác định hoạt độ phytase.
Xác định tế bào trong 1ml dịch môi trường tăng sinh Tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1
, 10-2, 10-3, 10-4…..10-10 trong các eppendof. Dùng phòng đếm hồng cầu để đếm số tế bào nấm men.
Hút 50ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ thích hợp cho vào phòng đếm hồng cầu. Quan sát trên kính hiển vi và đếm số tế bào nấm men có trong 5 ô lớn
Phòng đếm hồng cầu có 5 ô lớn, mỗi ô lớn chứa 16 ô nhỏ
Công thức tính số lượng tế bào nấm men có trong 1ml môi trường
Số tế bào = a x 5 x 104 x n(CFU/ml)
a : Số lượng tế bào trong một thị trường n : Độ pha loãng
104 : thể tích của một ô nhỏ trong thị trường (mm3) 5 : Số ô lớn được chọn để đếm tế bào
2.3.8 Tủa enzyme
2.3.8.1 Kết tủa bằng muối
Bản chất của nó là tạo tủa protein nhờ sự bổ sung vào dung dịch protein muối trung hòa ở nồng độ cao. Vì protein tồn tại trong dung dịch nhờ sự cân bằng giữa các lực tĩnh điện và các tương tác kỵ nước. Do đó khi bổ sung muối ở nồng độ cao thì sự cân bằng trên sẽ bị vi phạm dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và lắng chúng vào tủa từ dung dịch. Các phân tử protein trong dung dịch đều ngậm nước, khối lượng nước có thể lớn hơn nhiều lần khối lượng của bản thân protein. Lượng nước này che chắn một cách hữu hiệu các phần tử kỵ nước trên bề mặt của protein và cản trở tương tác giữa các phân tử protein, điều này dẫn đến sự lắng tủa protein.
Khi lựa chọn muối, cần phải tính đến giá trị pH của tiến trình phân đoạn. Trong thực tế phòng thí nghiệm (NH4)2SO4 thường được sử dụng nhiều nhất, vì nó có độ hòa tan cao ngay cả ở nhiệt độ thấp, và nó cũng không đắt. [8]
Số lượng (NH4)2SO4 cần bổ sung để đạt độ bão cần thiết được tính theo công thức [7]:
V: Thể tích của dung dịch ban đầu với nồng độ (NH4)2SO4 bằng C1 độ bão hòa
C2: Độ bão hòa cần đạt
X: Lượng (NH4)2SO4 khô tính theo g cần bổ sung để đạt độ bão hòa C2
2.3.8.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp lắng tủa protein bằng dung môi hữu cơ là tác động cơ bản của sự bổ sung dung môi hữu cơ là làm giảm khả năng tan của nước bao quanh protein. Điều này là do sự giảm lớn nước và sự cố định một
0,515V(C2-C1)
1-0,272 x C2 X=
phần các phân tử nước bởi quá trình hydrate hoá các phân tử của dung môi hữu cơ. Các phân tử nước sắp xếp một cách trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt của protein có thể được thay thế bằng các phân tử của dung môi hữu cơ, điều này sẽ làm gia tăng độ hòa tan của chúng. Các protein kỵ nước mạnh có khả năng tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ.
Một trong những vấnđề nảy sinh khi sử dụng dung môi hữu cơ là có thể xảy ra khả năng biến tính không thuận nghịch của protein. Do các phân tử protein chỉ thể hiện hoạt độ enzyme khi nó tồn tại trong cấu trúc không gian nhất định, sao cho các gốc phân cực phân bố trên bề mặt phân tử protein, còn các gốc kỵ nước không phân cực thì nằm trong lòng phân tử. Khi hằng số điện môi của môi trường giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng không hoạt động, trong đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc với dung môi. Hiện tượng này phụ thuộc vào nhiệt độ và xảy ra mạnh ngay ở cả nhiệt độ phòng. Do vậy quá trình lắng tủa protein bằng dung môi hữu cơ phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (4- 10oC) [8].
2.3.9 Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa lên hoạt độ
phytase
Sau khi nuôi lên men chủng nấm men ở môi trường, thời gian, tỉ lệ giống thích hợp, thu mẫu, ly tâm thu dịch lọc, dịch lọc chia đều đem đi tủa với các tác nhân cồn, acetone, muối, ly tâm lấy phần tủa, sấy khô (sấy chân không), hòa tan chế phẩm enzyme trong đệm natri acetate pH 5,5, xác định hoạt độ phytase.
2.3.10 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi lên hoạt độ
phytase
Ở mỗi tác nhân tủa ta tiến hành xác định tỉ lệ dung môi trên dung dịch enzyme.
Dịch môi trường sau lên men, ly tâm thu dịch lọc, dịch lọc chia đều đem đi tủa ở những tỉ lệ dung môi khác nhau cho những tác nhân tủa sau: Cồn 96o
không, hòa tan chế phẩm với đệm natri acetate pH 5,5, xác định hoạt độ phytase.
2.3.11 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tủa lên hoạt độ phytase
Dịch môi trường sau lên men, ly tâm thu dịch lọc, dịch lọc chia đều đem đi tủa bởi cùng một tác nhân với tỉ lệ tủa thích hợp, để tủa ở những thời gian khác nhau từ 2giờ, 4giờ, 6 giờ, 8 giờ, ly tâm lấy phần tủa, sấy chân không, hòa tan chế phẩm vớiđệm natri acetate pH 5,5, xác định hoạt độ phytase.
2.3.12 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase trên các dung dịch đệm sau (nồng độ 200mM): glycine-HCl, (pH 2,0; 2,5; 3,0; 3,5), natri acetate (pH 3,5; 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 ), và Tris-HCl (pH 7,0; 7,5).
pH tối ưu cho hoạt độ của enzyme được xác định bằng cách thực hiện phản ứng giữa enzyme và cơ chất trong các dung dịch đệm trên ở 37oC trong 15 phút. Sau đó xác định hoạt độ phytase để tìm ra dung dịch đệm thích hợp với pH tối ưu.
Xác định giá trị pH tại đó enzyme ổn định hoạt độ. Ủ enzyme trong các dung dịch đệm trên khoảng 24 giờ ở 2-4oC, sau đó xác định hoạt độ phytase ở 37oC trong 15 phút.
2.3.13 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase
Nhiệt độ tối ưu được xác định ở những nhiệt độ khác nhau từ 30-80oC tại pH tối ưu. Lần lượt thực hiện phản ứng enzyme-cơ chất ở các nhiệt độ 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80oC trong 15 phút sau đó xác định hoạt độ.
2.3.14 Khảo sát tính bền nhiệt của phytase
Khảo sát tính bền nhiệt của phytase bằng cách ủ enzyme trong dung dịch đệm pH tối ưu ở 60, 65, 70, 75, 80o
C trong các khoảng thời gian 5, 10, 15, 20, 40, 60 phút. Sau khi xử lý bằng nhiệt, mẫu được làm lạnh bằng nước đá và xác định hoạt độ phytase ở nhiệt độ tối ưu của nó.
Thực hiện ủ enzyme trong dung dịch đệm pH tối ưu ở nhiệt độ -20oC trong 67 ngày. Sau thời gian ủ này, enzyme được rã đông và xác định lại hoạt độ ở nhiệt độ tối ưu của nó.
2.3.16 Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt độ
phytase
Ủ dung dịch enzyme với các nồng độ 1mmol/ml và 5mmol/ml của các ion kim loại Ca2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, EDTA trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho dung dịch cơ chất vào, thực hiện phản ứng 15 phút ở 370
C, xác định hoạt độ phytase. Kết luận được các ion kim loại có ảnh hưởng lên hoạt độ phytase.
2.3.17 Tinh sạch phytase thu được bằng phương pháp sắc ký lọc
gel
Lấy enzyme phytase thu được, hòa tan trong đệm natri acetate với pH thích hợp như đã khảo sát ở phần 2.3.12.
Lấy dịch enzyme vừa pha đem đi chạy sắc ký theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.2.3.
Sau khi chạy sắc ký, tiến hành thu nhận các peak, xác định hàm lượng protein và hoạt độ của từng peak. Tính hiệu suất của quá trình sắc ký.
2.3.18 Phương pháp xác định hằng số Km
Khi một cơ chất S gắn với vị trí hoạt động của enzyme E, một phức hợp trung gian ES được hình thành. Trong quá trình chuyển đổi, cơ chất được chuyển thành sản phẩm. Sau một thời gian ngắn, thì sản phẩm tách ra khỏi enzyme. Quá trình này có thể được tóm tắt như sau:
Với: k1: hằng số tốc độ hình thành ES k2: hằng số tốc độ phân ly ES k3: hằng số tốc độ hình thành sản phẩm và giải phóng từ vị trí hoạt động E + S E S E + P k1 k2 k3
Hằng số Michaelis Km:
Phương trình Michaelis:
Ghi chú:
V: Vận tốc phản ứng Vmax: Vận tốc tối đa [S]: Nồng độ cơ chất Km: Hằng số Michaelis
Từ phương trình trên cho biết Km là hằng số đặc trưng cho phản ứng giữa 1 enzyme và một cơ chất dưới những điều kiện cụ thể.
Km = nồng độ cơ chất [S] khi V= ½ Vmax
Km phản ánh ái lực giữa enzyme và cơ chất, nghĩa là Km càng thấp thì
ái lực giữa enzyme và cơ chất càng mạnh và ngược lại. Km = k2 + k3 k1 V = Vmax[S] [S] + Km
Tuy nhiên để quá trình tính toán được chính xác hơn người ta thường sử dụng phương trình Lineweaver-Burk, nghịch đảo của phương trình Michaelis Km Vmax 1 V = . 1 [S] + 1 Vmax [S]
Hình 2.3: Đồ thị của phương trình Michaelis-Menten [34] Vi = vận tốc ban đầu (moles/thời gian)
[S] = nồng độ cơ chất (mole)
Vmax = vận tốc tối đa
Thực hiện phản ứng enzyme-cơ chất lần lượt ở các nồng độ cơ chất Na- phytate 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25mM với các thời gian 10, 15, 30, 45, 60 phút. Từ đó, ở mỗi nồng độ cơ chất [S] chọn một giá trị hoạt độ cao nhất là giá trị V.
Sử dụng chương trình Sigma plot 10.0, vẽ đồ thị của phương trình Lineweaver-Burk theo nồng độ cơ chất [S] và giá trị hoạt độ V tương ứng. Từ đó xác định Km và Vmax. [8], [25]
Hình 2.4 : Đồ thị của phương trình Lineweaver-Burk [28] y = 1/Vmax, và x = -1/Km
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN
3.1 Chọn giống vi sinh vật sinh phytase
Từ bộ sưu tập về nấm men thu thập từ rừng Nam Cát Tiên, chúng tôi đã sàng lọc và xác định những chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp phytase (Trương Thị
Thùy Vân, 2008), ( Bảng 3.1)
Bảng 3.1: Những chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp phytase
Tên loài Khả năng sinh tổng
hợp phytase
Candida dendronema -
Candida fermentati strain EXOC5 -
Candida fermentati strain VTT C-04519 +
Candida naeodendra partial -
Candida parapsilosis +
Candida parasilosis strain EXOC16 +
Candida rugosa - Candida sp.ST-164 - Candida sp.ST-358 - Candida sp.ST-366 + Candida sp.UWO(PS)00-147.3 - Cryptococcus CBS 8368 - Cryptococcus laurentii KCTC 7831 -
Cryptococcus liquefaciens strain MZKI-490 (L40) ++
Metschnikowia koreensis KCTC 7998 - Pichia hampshirensis - Pichia lachance - Pichia rabaulensis - Pichia sydowiorum - Pseudozyma sp.HB 1203 -
Rhodotorula mucilaginosa strain CBS8383 -
Saccharomyces cerevisae +
Sporidiobolus ruineniae IGC 5692 -
Sporidiobolus ruineniae strain IGC 5692 -
Sporobolomyces carnicolor - Sporobolomyces carnicolor (L62) ++ Sporobolomyces japonicus (L9) ++ Sporobolomyces sp.CBS 6166 - Sporobolomyces sp.CBS 6166 - Sporobolomyces sp.TY-228 - Ustilago alcornii - Ustilago esculenta -
Ghi chú: Dấu (-): Chủng nấm men không có khả năng sinh tổng hợp phytase Dấu (+): Chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp phytase
Dấu (++): Chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp phytase nhiều hơn những chủng có dấu (+).
Dựa vào kết quả của nghiên cứu này, chúng tôi chọn ra 3 chủng nấm men có khả
năng sinh tổng hợp phytase cao nhất, và tiến hành thí ngiệm trên môi trường Schopfer (Ca-phytate) là môi trường chọn lọc ra chủng nấm men sinh tổng hợp phytase. Thực hiện việc chọn lọc trên 3 chủng:
Sporobolomyces japonicus (AY070009) (L9)
Sporobolomyces carnicolor (L62)
Cryptococcus liquefaciens strain MZKI K-490 (L40) Phân lập và chọn khuẩn lạc đặc trưng của 3 chủng trên, mỗi chủng lấy một khuẩn lạc và chấm lên môi trường Schopfer theo mục (2.3.2) để quan sát vòng phân giải sau 48 giờ. Chúng tôi thu được kết quả theo hình 3.1
Hình 3.1 : Vòng phân giải của các chủng sinh phytase trên môi trường Schopfer (Ca-phytate)
Nhận xét:
Quan sát vòng phân giải của 3 chủng L9, L40, L62 chúng tôi thấy rằng chủng L9
có vòng phân giải lớn nhất, lớn thứ hai là chủng L40 và cuối cùng là chủng L62. Thí nghiệm này nhằm định tính khả năng sinh tổng hợp phytase dựa vào so sánh vòng phân giải giữa các chủng trên môi trường Schopfer. Nhưng để xác định chính xác hơn khả năng sinh tổng hợp phytase, chúng tôi tiếp tục xác định hoạt độ phytase sơ bộ của 3 chủng đã chọn.
3.2. Xác định hoạt độ phytase sơ bộ của các chủng nấm men có vòng phân giải lớn từđó chọn ra chủng nấm men có hoạt độ phytase cao nhất phân giải lớn từđó chọn ra chủng nấm men có hoạt độ phytase cao nhất
Thực nghiệm: Mỗi giống ta cho lên men vào mỗi bình erlen chứa 100ml môi trường YPD 0,5% Na-phytate trong 5 ngày, thu mẫu, ly tâm thu dịch lọc và đem xác định hoạt độ phytase theo mục (2.2.1.2) hệ số pha loãng d = 50, xác định hàm lượng protein theo mục (2.2.2) với hệ số pha loãng d = 20. Chúng tôi thu được kết quả theo bảng 3.2, hình 3.2:
Bảng 3.2: Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật Mật độ quang Hàm lượng protein Mật độ quang HĐ chung Chủng khảo sát
ΔODtb mg /ml ΔODtb UI/ml
L9 0,291 0,05 0,042 1,46 L40 0,154 0,03 0,013 0,45 L62 0,186 0,03 0,010 0,35 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 L9 L40 L62 Chủng vi sinh vật Ho ạ t độ
chung phytase UI/ml
Hình 3.2: Hoạt độ phytase theo chủng vi sinh vật sinh tổng hợp phytase cao. Nhận xét:
Sau khi xác định hoạt độ phytase từ dịch chiết thô của các chủng nấm men khảo sát, chúng tôi nhận thấy chủng L9 cho hoạt độ cao nhất 1,46UI/ml, nên chúng tôi chọn chủng L9 được định danh là Sporobolomyces japonicus theo (genBank: AY07009.1)để nghiên cứu phytase .
3.3. Chọn lọc môi trường thích hợp cho nấm men sinh phytase cao nhất