Có sự tăng inositol phosphate và phospholipid khi chúng đóng vai trò quan trọng truyền tín hiệu qua màng tế bào và huy động calcium dự trữ trong nội bào, vì thế nó đạt kết quả cần thiết cho những chế phẩm inositol phosphate khác. Dẫn xuất inositol phosphate cho thấy việc sử dụng chúng như là chất ổn định enzyme, các cơ
chất của enzyme cho các nghiên cứu biến dưỡng khác nhau. Myo-inositol cũng có
ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Số lượng và vị trí của nhóm thì ảnh hưởng rất lớn đến chức năng sinh lý của chúng. [16]
Kết quả của sự thủy phân myo-inositol hexakisphosphate (IP6) bởi phytase sẽ
giải phóng các inositol phosphate khác nhau thấp hơn (IPs), mà nó rất có ích trong nghiên cứu những tác động sinh lý của chúng.
Cốđịnh tế bào của C.krusei trong gel Ca-alginate thì cho các chế phẩm Ips khác nhau và các đồng phân tinh sạch. Sau đó được phân tách bằng sắc ký trao đổi ion.
Phytase của S.cerevisae được sử dụng để sản xuất chế phẩm D-myo-inositol 1,2,6-triphosphate, D-myo-inositol 1,2,5-triphosphate, L-myo-inositol 1,3,4- triphosphate và L-myo-inositol 1,2,3-triposphate (Siren, 1986b).
CÁC ĐỒNG PHÂN INOSITOL
cis-INOSITOL epi-INOSITOL allo-INOSITOL
(CAS RN: 643-10-7) neo-INOSITOL (CAS RN: 488-54- 0) myo-INOSITOL (CAS RN: 87- 89-8) muco-INOSITOL (CAS RN: 41546-34-2) scyllo-INOSITOL (CAS RN: 488-59-5) L-(-)-chiro- INOSITOL (CAS RN: 551-72- 4) D-(+)-chiro-INOSITOL (CAS RN: 643-12-9) Hình 1.6: Các đồng phân inositol [31]
1.4.8 Phân loại Sporobolomyces japonicus [27], [28], [33] Giới: Nấm Ngành: Basidiomycota Lớp: Ustilaginomycetes Bộ: Ustilaginales Họ: Ustilaginaceae Giống: Sporobolomyces
Loài: Sporobolomyces japonicus
1.4.9 Ứng dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi
Thức ăn chăn nuôi chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật và khoảng 2/3 phospho trong thức ăn có nguồn gốc từ thực vật ở dạng phytate phospho.
Sự kết hợp phytase trong thức ăn sẽ làm giảm sự bổ sung phospho vào. Điều này sẽ cải thiện cho quá trình tiêu hóa và có nghĩa là nó có giá trị dinh dưỡng trong thức
ăn chăn nuôi, do đó tốc độ tăng trưởng của động vật có dạ dày đơn như : heo, gà, gia cầm, tăng trưởng đáng kể và cũng làm giảm sự ô nhiễm môi trường gây ra bởi sự loại thải phospho.
Có 2 cách cơ bản sử dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi: • Khả năng đầu tiên là thay thế chất bổ sung Pi bằng phytase.
• Cách thứ 2 của việc sử dụng phytase là tiền xử lý thức ăn chăn nuôi để giảm lượng phytate trong thành phần thức ăn.
Những kết quả thực nghiệm từ các phòng thí nghiệm lớn đã xác định rằng 500- 1000U phytase có thể thay thế khoảng 1g Pi bổ sung và giảm sự thải phospho ra ngoài môi trường 30-50% [13], [16]
1.4.10 Ứng dụng phytase trong thực phẩm
Sự hiện diện của phytase trong thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật thì đã được biết rõ và khá phổ biến. Một lượng lớn dân số có xu hướng bị tác động xấu đến việc thiếu hụt sắt và kẽm do sự hấp thu thực phẩm giàu phytate từ thực vật, và những nghiên cứu trên con người đưa ra rằng sự hấp thu kẽm và sắt từ bữa ăn có sự đối lập với thành phần phytate của nó. Phytase thực phẩm thì bị mất hoạt tính trong quá trình nấu và do đó sự tiêu thụ phytate sẽ kém đi và kết quả là ảnh hưởng đến sự
hấp thu các chất khoáng trong ruột non. Phytase bổ sung có thể đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của con người, và cả việc làm giảm bớt sự mất hoạt tính phytase trong quá trình nấu và trong dạ dày ruột. Việc sử dụng an toàn qua hàng chục năm cũng như vai trò probiotic của chúng, làm cho chúng trở thành một nguồn tốt hơn đối với các vi sinh vật khác.
Một ứng dụng quan trọng khác của phytase trong sản xuất bánh mì là nó được sử dụng để làm giảm thấp thành phần phytin trong bánh mì. Trong tổng lượng bột bánh mì thì phytate hiện diện ở mức 0,29-1,05% (w/w). Mặc dù thông thường lượng phytate trong tổng lượng bột bánh mì giảm 50-60% trong quá trình nướng, và sự giảm này gây nên sự thiếu nước mà nước giúp tăng đáng kể các đặc tính sinh học sẵn có trong chất khoáng.
Một số nghiên cứu hoạt tính phytase trong nấm men nướng bánh và nhiều nhà nghiên cứu nhấn mạnh vai trò của phytase nấm men trong quá trình làm bánh mì. Trong suốt quá trình làm bánh mì, việc giảm hàm lượng phytate được xem là kết quả của quá trình nướng bánh và do hoạt tính của phytase. Việc sử dụng lượng nấm men cao và thời gian lên men dài trong quá trình lên men dài nhằm duy trì lượng chất xơ cao với lượng phytate thấp.
Ngoài ra phytase còn ứng dụng trong sản xuất sữa đậu nành, do trong sữa đậu nành phytate chiếm 0,56%.
Do đó phytase nấm men có lẽ được ứng dụng trong quá trình chế biến thực phẩm để sản xuất thực phẩm chức năng. [16]
1.4.11 Tiềm năng trong ngành thủy sản
Trong nuôi trồng thủy sản, chi phí cho thức ăn lên đến 70% trong toàn bộ chi phí sản xuất. Nhiều nghiên cứu được tiến hành vào việc dùng bã đậu nành hoặc bã thực vật khác trong nuôi trồng thủy sản để thay thế cho protein giá cao hơn như khi dùng cá khô. Tuy nhiên, ảnh hưởng kháng dinh dưỡng của acid phytic là một vấn đề đối với cá do ống tiêu hóa của chúng ngắn, chính điều này gây trở ngại cho việc sử
dụng protein có nguồn gốc từ thực vật làm thức ăn cho cá. Do đó, phytase được
đánh giá như là một chất làm tăng khả năng sử dụng protein thực vật với chi phí thấp trong ngành nuôi trồng thủy sản cũng như duy trì mức độ phospho cho phép ở
trong nước. Nấm men và phytase nấm men có lẽ cải thiện nguồn nước bẩn và nước mặn trong nuôi trồng thủy sản do vai trò probiotic của chúng. [16]
1.4.12 Định hướng tương lai
Nghiên cứu phytase nấm men có thể quan trọng với nhiều nguyên nhân. Do phytase nấm mốc đặc biệt là Aspergillus spp, đã được nghiên cứu khá nhiều do ứng dụng của chúng trong bổ sung vào thức ăn chăn nuôi làm tăng hàm lượng phospho và các khoáng chất. Tuy nhiên, trong thực phẩm cho con người, thì phytase không có sẵn. Nhờ vào khả năng hầu như không gây bệnh, nấm men được chọn làm nguồn sản xuất phytase để ứng dụng trong thực phẩm cho con người. Hơn thế nữa, IP6 là một hợp chất phổ biến trong tự nhiên, nấm men sẽ dễ dàng sử dụng chúng. Do đó hoạt tính thủy phân phytate sẽ rất quan trọng cho nấm men để biến dưỡng phospho và inositol. Khả năng sản sinh phytase đạt giá trị hiệu quả và nghiên cứu mã hóa gen nấm men sinh phytase cũng không được nghiên cứu sâu, vì thế những nỗ lực nghiên cứu nhiều hơn được gọi là khám phá ra các phytase mới từ nguồn nấm men. Từ trước đến nay rất ít loài được biết và để phát triển quá trình sản xuất ở phạm vi rộng lớn. Kỹ thuật sản xuất phytase ra đời để đáp ứng nghiên cứu những đặc điểm về pH, ổn định nhiệt độ, cơ chất đặc hiệu và tốc độ xúc tác cao hơn.
Cho đến bây giờ, chỉ những trình tự sơ khởi của 2 loài nấm men sinh phytase
được nghiên cứu và vì thế cần thiết phải phân lập và giải trình tự các gen sinh phytase của các nấm men khác nhau để hiểu rõ về cấu trúc phân tử 3D, nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng. [16]
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm men Sporobolomyces japonicus được phân lập từ Vườn Quốc Gia Cát Tiên, trong bộ sưu tập của Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM.
2.1.2 Dụng cụ và thiết bịü Bình tam giác ü Bình tam giác ü Bình định mức ü Bình hút chân không ü Cốc đốt ü Đĩa petri ü Đèn cồn ü Đũa thủy tinh ü Giấy lọc ü Ống hút ü Ống nghiệm ü Ống đong
ü Phễu thủy tinh/nhựa ü Phòng đếm hồng cầu ü Que cấy ü Bể ổn nhiệt ü Bếp điện ü Bộ điện di ü Bộ sắc ký lọc gel (Bio- Rad) ü Cân phân tích ü Kính hiển vi quang học ü Lò vi sóng
ü Máy đông khô ü Máy khuấy từ ü Máy lắc ü Máy li tâm ü Máy quang phổ ü Máy sấy chân không ü Máy vortex ü Nồi hấp khử trùng ü pH kế ü Tủ ấm ü Tủ cấy ü Tủ lạnh ü Tủ sấy
2.1.3 Hóa chất và cách pha dung dịch hóa chất
2.1.3.1 Hóa chất
Nhóm vô cơ
Muối
2. Amonium persulphate (NH4)2S2O8 3. Amonium sulphate (NH4)2SO4 4. Calcium clorate CaCl2
5. Copper sulphate CuSO4.5H2O 6. Ferrous sulphate FeSO4/Fe2(SO4)3 7. Magnesium sulphate MgSO4.7H2O 8. Mangansium sulphate MnSO4.H2O
9. Potassium antimony tartrate C8H4K2O12Sb2 .3H2O 10. Potassium clorate KCl
11. Potassium dihydrophosphate KH2PO4 12. Trisodium phosphate Na3PO4
13. Zinc sulphate ZnSO4.7H2O
Acid 14. Acid clohyric đậm đặc 15. Acid phosphoric 16. Acid sulfuric đậm đặc 17. Acid clohydric Nhóm hữu cơ
18. Sodium phytate (Na- phytate)C6H6(OP3Na2)6 19. Calcium phytate (Ca-phytate)
20. Acid ascorbic C6H8O6 21. Acid tricloroacetic (TCA) 22. Acid acetic
23. EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 24. Dung dịch albumin
25. Glycine
26. Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad)
27. Hỗn hợp Acrylamide và Bisacrylamide 30% (BioRad) 28. SDS (sodium dodecyl sulphate)
29. TEMED (N,N,N’,N’- tetramethylene-ethylenediamine)
31. Bromophenol blue (BHD) 32. Dithiothreitol (DTT) 33. Glycerol 34. Ethanol 35. Methanol Dung dịch đệm 37. Đệm acetate 38. Đệm glycine-HCl 39. Đệm Tris-HCl Thuốc thử
40. Coomassive Brilliant blue 41. Thuốc thử Bradford (Bio-Rad)
2.1.3.2 Cách pha các dung dịch hóa chất
v Các hóa chất dùng để xây dựng đường chuẩn phospho và xác
định hoạt độ enzyme
- Đường chuẩn KH2PO4 cho thí nghiệm xác định hoạt độ phytase.
Chuẩn bị 9mM dung dịch phosphate stock: Cân 1,224g KH2PO4 thêm dung dịch đệm acetate pH 5,5 đến 1000ml.
Bảng 2.1: Pha dung dịch phospho chuẩn
Pha loãng 9mM dung dịch phosphate Nồng độ phosphate mM 1:1600 5,625 1:800 11,25 1:400 22,5 1:200 45 1:100 90 - Dung dịch đệm acetate 0,2M, pH 5,5
Pha dung dịch acid acetic 0,2M (dung dịch A): hút 11,55ml CH3COOH đậm đặc vào nước và định mức đến 1000ml.
Pha dung dịch natri acetate 0,2M (dung dịch B): cân 16,4g
CH3COONa hoặc 27,2g CH3COONa.3H2O được hòa tan trong nước và định mức đến 1000ml.
Điều chỉnh pH của dung dịch đệm phụ thuộc vào số ml dung dịch A và số ml dung dịch B dẫn nước đến 100ml. Tiến hành pha theo các bước sau:
Dung dịch A 8,8ml Dung dịch B 41,2ml pH 5,4
Do pH cần điều chỉnh là 5,5 nên tiếp tục cho từ từ dung dịch B vào đến khi pH kế hiện 5,5.
- Dung dịch cơ chất: 1% (9mM) Na- phytate trong đệm acetate 0,2M, pH 5,5
- TCA 15% (W/V): 15g TCA dẫn nước đến 100ml, để ở nhiệt độ phòng
- Thuốc thử màu (Chỉ dùng trong ngày)
Pha acid sulfuric 1M
Pha ammonium molybdate 2,5% Pha acid ascorbic 10% (W/V)
Trộn 3 thể tích acid sulfuric 1M với 1 thể tích ammonium molybdate 2,5%, sau đó cho 1 thể tích acid ascorbic 10% vào và trộn đều
v Các hóa chất xác định hàm lượng protein
- Dung dịch albumin 100mg/ml: Cân 10mg albumin pha với nước cất thành 100ml.
- Thuốc nhuộm Bradford:Hòa tan 10mg Coomassive Brilliant Blue vào 50ml ethanol 96oC, thêm 100ml H3PO485%, định mức với nước cất đến 1000ml.
v Các dung dịch đệm dùng trong khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ enzyme
a. Dung dịch Glycin 0,2M: cân 15,1g glycin (C2H5NO2) được hòa tan và thêm nước đến 1000ml.(X)
b. Dung dịch HCl 0,2M: hút 16,8ml HCl đậm đặc (37%) pha thành 1000ml.(Y).
Để pha được các dung dịch đệm có pH: 2,0 ; 2,5 ; 3,0; 3,5, hút 50ml dung dịch (X) sau đó nhỏ từ từ dung dịch(Y), đo pH đến khi đạt được pH mong muốn và định mức đến 200ml. Bảo quản trong tủ lạnh (40C).
- Đệm Natri acetate pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5, 6,0; 6,5; 7,0.
a. Dung dịch acid acetic 0,2M: hút 11,55ml CH3COOH đậm đặc và thêm nước đến vừa đủ 1000ml.
b. Dung dịch Na-acetate 0,2M: cân 16,4g CH3COONa hoặc 27,2g CH3COONa.3H2O, hòa tan và thêm nước đến 1000ml.
Để pha được 50ml các dung dịch đệm Na-acetate có giá trị pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0, thực hiện pha theo bảng sau:
Bảng 2.2: Pha đệm natri acetate pH 3,5-7,0
Đệm Natri
acetate Dung dịch (X)(ml) Dung dịch (Y)(ml) pH 3,5 46 Nhỏ từ từ đến pH 3,5 pH 4,0 41 Nhỏ từ từ đến pH 4,0 pH 4,5 27 Nhỏ từ từ đến pH 4,5 pH 5,0 Nhỏ từ từ đến pH 5,0 35 pH 5,5 Nhỏ từ từ đến pH 5,5 44 pH 6,0 Nhỏ từ từ đến pH 6,0 47 pH 6,5 Nhỏ từ từ đến pH 6,5 49 pH 7,0 Nhỏ từ từ đến pH 7,0 50
Sau khi chỉnh pH đúng như pH cần, mỗi dung dịch đem định mức đến 100ml và bảo quản trong tủ lạnh (40C).
- Đệm Tris-HCl pH 7,0; 7,5; 8,0:
a. Dung dịch Tris bazơ 0,2M: cân 24,24g Tris bazơ hòa tan và thêm nước cất đủ 1000ml.
b. Dung dịch HCl 0,2M: hút 16,8ml HCl đậm đăc (37%) và thêm nước cất đủ 1000ml
Để pha được các dd đệm Tris-HCl có pH 7,0; 7,5; 8,0, lấy 50ml dung dịch (a) và thêm từ từ dung dịch (b) đến khi đạt được pH cần pha. Sau đó đem dịnh mức đến 200ml và bảo quản trong tủ lạnh (40C).
v Các hóa chất dùng để khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt độ enzyme
Pha dung dịch các muối MnSO4, CuSO4, FeSO4, Fe2(SO4)3, MgSO4, CaCl2, ZnSO4, EDTA có nồng độ 10mmol/ml như sau:
Bảng 2.3: Pha dung dịch ion kim loại và chất ức chế EDTA
Muối Mn2+ Mg2+ Ca2+ Fe2+ Fe3+ Zn2+ Cu2+ EDTA MnSO4.H2O (g) 0,0845 MgSO4.7H2O (g) 0,1232 CaCl2 (g) 0,0555 FeSO4.7H2O (g) 0,1390 Fe2(SO4)3 (g) 0,1999 ZnSO4.7H2O (g) 0,1438 CuSO4.5H2O (g) 0,1248 EDTA (g) 0,1321
Nước cất Thêm nước cất vừa đủ 50ml
v Các hóa chất dùng trong chạy điện di
- Hỗn hợp Acrylamide và Bisacrylamide 30% (BioRad) Ion kim
- Tris (2-hydoxymethyl sulphate) - SDS - TEMED - Amonium persulphate - 2- mercaptoethanol - Glycerol - Bromophenol blue - Glycine - Acid hydrocloric - Dithiothreitol (DTT)
Pha dung dịch stock
- Tris-HCl 2M (pH 8,8), 100ml
Cân 24,2g Tris base, thêm 50ml nước cất, thêm acid HCl đậm đặc từ từ để điều chỉnh về pH 8,8 (khoảng 4ml), để dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, pH sẽ tăng. Thêm nước đến 100ml
- Tris-HCl 1M (pH 6,8), 100ml
Cân 12,1g Tris base, thêm 50ml nước cất, thêm acid HCl đậm đặc từ từ điều chỉnh về pH 6,8 (khoảng 8ml), để dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, pH sẽ tăng. Thêm nước đến 100ml
- SDS 10% (W/V), 100ml, dự trữ ở nhiệt độ phòng
Cân 10g SDS, hoàn tan trong nước và thêm nước đến 100ml
- Glycerol 50% (V/V), 100ml
50ml glycerol 100% thêm 50 nước cất
- Bromophenol blue (W/V), 10ml
Cân 10mg bromophenol blue hoàn tan trong 10ml nước cất, khuấy cho đến khi hòa tan hết. Lọc để loại bỏ thuốc nhuộm còn tủa lại.
- Dung dịch nhuộm protein1lít
Coomassive Blue R-250 1g
Methanol 450ml
Nước cất 450ml
- Dung dịch giải nhuộm
Methanol 100ml
Glacial acid acetic 100ml
Nước cất 800ml
- Thang phân tử protein: Dùng thang chuẩn SDS-PAGE của Bio- Rad
Pha dung dịch làm thí nghiệm
- Dung dịch đệm (gel phân tách) 4x, 100ml
Tris-HCl 2M (pH 8,8) 75ml 1,5M
SDS 10% 4ml 0,4%
Nước khử ion 21ml Ổn định vài tháng trong tủ lạnh.
- Dung dịch đệm (gel gom) 4x, 100ml
Tris-HCl (pH 6,8) 50 ml 0,5M SDS 10% 4ml 0,4% Nước khử ion 46ml Ổn định vài tháng trong tủ lạnh - Amonium persulphate 10%, 5ml Amonium persulphate 0,5g Nước khử ion 5ml
Ổn định vài tháng trong ống nghiệm có nắp đậy để trong tủ lạnh.
- Đệm chạy điện di, 1000ml
Tris 3g 25mM
Glycine 14,4g 192mM
SDS 1g 0,1%
Thêm nước vào đến 1000ml, pH khoảng 8,3. Ổn định vô hạn ở nhiệt độ phòng.
- Đệm pha mẫu 5x, 10ml
Tris-HCl 1M (pH 6,8) 0,6ml 60mM Glycerol 50% 5ml 25%
2-mercaptoethanol 0,5ml 14,4mM Bromophenol blue 1% 1ml 0,1%
Nước 0,9ml
Ổn định vài tháng trong tủ lạnh hay vài tháng ở nhiệt độ -20oC v Các hóa chất dùng trong sắc ký lọc gel
- Biogel P-100 của hãng Bio-Rad - Đệm acetate 0,2M, pH 4,0
2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy và cách pha các môi