v Nguyên tắc:
Sử dụng một nguyên liệu có tính chất hạt gel, đưa các hạt gel vào cột. Chuyển dung dịch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất định, khi mở van ở đáy, ta lần lượt thu nhận các phân đoạn khác nhau có trọng lượng phân tử khác nhau.
Các gel được sử dụng chủ yếu hiện nay là sephadex, một dextran (oligosaccharide) được cấu tạo từ nhiều đơn vị a-glucose nối với nhau bằng liên kết 1,2 ; 1,4 ; 1,6 ; 1,3 O-glucoside. Do có nhiều liên kết tạo thành một mạng lưới, sephadex có khả năng hút nước, trương nở. Khi ngâm các hạt gel trong nước thì trong vài giờ sẽ tạo thành hai pha khác nhau:
o Pha mạng: gồm các mạng lưới liên kết trong hạt gel
o Pha loãng: pha nằm giữa các hạt gel và được phủ đầy bởi dung môi hoặc nước.
Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột chứa các hạt gel sephadex trương nở thì xảy ra quá trình tách những phần tử có kích thước trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua một cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel và do đó sẽ di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phần tử nhỏ. Kết quả là tách được các chất có trọng lượng phân tử khác
nhau thành các phân đoạn theo trình tự: Các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn sẽ ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ sẽ ra sau. [1]
Hình 2.1 : Hệ thống sắc ký lọc gel của Bio-Rad.
v Tiến hành thực nghiệm [6]
- Thiết bị và hóa chất
Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 50 x 1,5cm, thể tích 88ml
Biogel P-100 của hãng Bio-Rad là dạng hạt mịn, kích thước hạt 45- 90nm, khả năng ngậm nước là 12ml/g gel khô, phạm vi phân tách là 5000- 150000 daltons.
Đệm acetate 0,2M pH 4,0 khử bọt khí trước khi dùng
- Chuẩn bị gel và nhồi cột
Cân 8g gel khô vào erlen 500ml, cho nước cất từ từ khoảng 250ml. Để qua đêm cho quá trình hydrate hóa xảy ra, sau khi hydrate hóa hoàn toàn chuyển dung dịch vào hệ thống hút chân không để khử khí (khoảng 60 phút)
Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp 2 lần lớp gel nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Loại lớp nổi trên bề
mặt bằng cách hút, lặp lại nhiều lần để loại hầu hết các hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
Gắn phiễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột.
Rót đều dung dịch gel vào cột thành cột dòng di chuyển nhẹ, tránh bọt khí.
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel
Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thề tích lớp nền chảy qua cột đồng thời với việc điều khiển tốc độ dòng chảy.
Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Khi tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị.
- Nạp mẫu chạy sắc ký
Mẫu sau khi tủa bằng dung môi thích hợp, đem sấy khô, cân và hòa vào đệm acetate 0,2M, pH 4,0.
Dùng ống tiêm bơm 2ml mẫu vào cột sắc ký.
Dịch ra khỏi cột được thu tự động vào các ống nghiệm, mỗi phân đoạn 2ml và được đo ở bước sóng 280nm bằng detector trong bộ sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính.
Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành thu các peak và đem xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzyme, điện di SDS-PAGE, xác định trọng lượng phân tử protein.
- Tính toán:
So sánh hoạt độ riêng của enzyme trước và sau khi lọc qua gel
Hoạt độ riêng UI/ml Protein/ml
UI/ml: hoạt độ của 1ml dịch enzyme
Protein/ml: hàm lượng protein của 1ml dịch enzyme
Tính hiệu suất hoạt độ của enzyme và hàm lượng protein thu được
qua lọc gel
HHT%: Phần trăm hiệu suất hoạt độ enzyme V: Tổng thể tích enzyme cho vào lọc gel X: Hoạt độ của enzyme cho vào lọc gel V1: Tổng thể tích của peak 1
X1: Hoạt độ của peak 1 V2: Tổng thể tích của peak 2 X1: Hoạt độ của peak 2
HP%: Phần trăm hiệu suất protein của enzyme V: Tổng thể tích enzyme cho vào lọc gel
Y: Hàm lượng protein của enzyme cho vào lọc gel V1: Tổng thể tích của peak 1
Y1: Hàm lượng protein của peak 1 V2: Tổng thể tích của peak 2 Y1: Hàm lượng protein của peak 2