v Nguyên tắc:
Các protein được phản ứng với các chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để tạo thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithithreitol (DTT) để phá vỡ cầu nối
HHT % V1.X1 + V2.X2 +…. V.X
HP% V1.Y1 + V2.Y2 +…. V.Y
S-S- (disulfur) của protein và các tiểu đơn vị của chúng. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ.
Mục đích của phương pháp điện di là để đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử chuẩn là hỗn hợp protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.
Tốc độ di chuyển của protein trong phương pháp điện di phụ thuộc vào: § pH của môi trường (pH môi trường làm thay đổi điện tích của phân tử protein do đó phải dùng dung dịch đệm để duy trì một pH ổn định)
§ Hình dáng và trọng lượng phân tử § Cường độ điện trường
§ Nhiệt độ
§ Tính chất của giá mang (giấy, acetate, cellulose, gel) sẽ ảnh hưởng ít nhiều đến sự di chuyển của protein.
Lớp gel gom mục đích làm cho các protein trong mẫu được dồn lại thành băng mỏng, lớp gel phân tách sẽ tạo ra các băng protein có kích thước khác nhau từ cùng một điểm xuất phát. [2]
v Tiến hành thí nghiệm
hộp điện di, dụng cụ làm gel (tấm kính, lược kẹp, micropipet).
- Thao tác lắp gắn khung gel vào:
Sau khi lau các tấm kính bằng ethanol 70%, thì lắp kính vào khung gel.
- Chuẩn bị đổ gel:
Gel phân tách (Separating gel)12%
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào các cốc thủy tinh 50ml Acrylamide/Bisacrylamide 30% : 4ml
Separating gel buffer pH 8,8 : 2,5ml
Nước cất : 3,445ml
TEMED : 5ml
Amonium persulfate 10%: 50ml
Dùng pipetman trộn đều hỗn hợp gel, sau đó bơm dung dịch vào khuôn đổ gel sao cho gel cách mép của tấm kính khoảng 2cm, nhẹ nhàng cho một lớp nước cất lên trên lớp gel vừa đổ để quá trình polymer hóa xảy ra.
Gel gom (Stacking gel) 5%
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc thủy tinh 50ml Acrylamide/Bisacrylamide 30%: 0,67ml
Stacking gel buffer pH 6,8: 1ml
Nước cất : 2,3ml
TEMED : 4ml
Amonium persulfate 10%: 20ml
Sau khi gel phân tách đã polymer hóa hoàn toàn (khoảng 30-45 phút), hút hết lớp nước bên trên. Và tiếp tục dùng pipetman đổ từ từ lớp gel gom vào, đưa lược vào gel để tạo các giếng. Đợi khoảng 30 phút để gel polymer hóa, nhẹ nhàng lấy lược ra, loại bỏ phần gel acrylamide thừa bằng cách dùng khăn giấy thấm cho sạch và lắp đĩa gel vào bộ điện di, đổ dung dịch đệm điện di vào buồng điện di sao cho vừa ngập qua khuôn gel.
- Xử lý mẫu
Hút 40ml protein mẫu và thêm 10ml đệm pha mẫu 5x vào trong 1 eppendof.
Đun nóng 100o
Ly tâm 130000vòng/phút trong 30 giây
- Nạp mẫu
Cho đệm điện di vào buồng điện di
Dùng pippetman hút mẫu cho nhẹ nhàng vào giếng, mỗi giếng nạp 20ml mẫu. Lượng protein tối đa cho mỗi giếng là 20-40mg.
Cẩn thận tránh bọt khí xuất hiện trong quá trình bơm mẫu vào giếng.
- Chạy điện di
Đậy hộp điện di cắm 2 đầu điện cực vào nguồn điện, chỉnh cường độ dòng điện 110mA. Thời gian điện di khoảng 60-90 phút. Sau khi front nhuộm chạy đến cuối miếng gel, tắt nguồn điện và lấy tấm gel ra.
- Nhuộm màu sau điện di SDS-PAGE
Lấy gel ra và cho vào một hộp nhỏ chứa 30ml thuốc nhuộm Coomassive. Đậy nắp lại và đặt hộp trên máy lắc nhẹ trong vòng 30 phút.
- Giải nhuộm
Sau khi nhuộm xong, đổ thuốc nhuộm và rửa nước cho miếng gel vài lần.
Cho khoảng 60ml thuốc giải nhuộm vào hộp chứa gel, giải nhuộm trong 60 phút và ta có thể thấy các vạch protein.
Dùng nước cất cho vừa đầy qua mặt gel và để lắc nhẹ qua đêm, để giải nhuộm hoàn toàn.
* Lưu ý: khi thao tác phải đeo găng tay để tránh dấu vân tay trên gel đồng thời tránh thuốc nhuộm dính vào tay.
- Xác định trọng lượng phân tử của protein [12]
Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad) gồm các protein chuẩn có kích thước xác định như sau:
Phosphorylase b 97.400 Daltons Bovine serum albumin 66.200 Daltons Ovalbumin 45.000 Daltons Carbonic anhydrase 31.000 Daltons Chất kìm hãm trypsin từ đậu nành 21.500 Daltons
Tiến hành đo khoảng cách di chuyển của các protein trong thang chuẩn, protein mẫu (phytase), và đo khoảng cách di chuyển phẩm nhuộm (bromophenol blue). Khoảng cách di chuyển được đo từ đầu gel phân tách cho đến mép của vạch protein.
Tính toán giá trị Rf
Tính lg của trọng lượng phân tử các protein chuẩn đã biết, vẽ đồ thị tương quan giữa lg trọng lượng phân tử của protein thang chuẩn với Rf.
Dựa vào đường chuẩn ta sẽ xác định trọng lượng phân tử protein chưa biết (phytase) nhờ vào giá trị Rf của nó.