• Nhiệt độ: Trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, thì nhiệt độ
tối ưu cao của phytase thì rất cần thiết. Vì quá trình sản xuất thức ăn chăn nuôi phải trải qua công đoạn tạo viên thì nhiệt độ lên đến 80-85oC trong vài giây.
- Phytase của S.castelli, A.adeninivorans hoạt động trong khoảng 75- 80oC
- Phytase của Schwanniomyces hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 77oC
- Nhiệt độ tối ưu của Pichia rhodanensis, P.spartinae và P.anomala lần lượt là 70-75oC, 75-80oC, 60oC
- Trong khi đó phytase của C.krusei WZ001 hoạt động tối ưu tại nhiệt
độ 40oC.
- Sự bền nhiệt của phytase được cho là rất quan trọng và là một tiêu chí rất hữu ích để ứng dụng làm phụ gia trong thức ăn chăn nuôi do yêu cầu về khả năng chịu nhiệt của phytase trong giai đoạn làm thức ăn dạng viên. Đối với S.castellii thì phytase ổn định ở 74oC trong 1 giờ, còn C.krusei dễ dàng mất hoạt tính khi nhiệt độ vượt quá 50oC.
Phytase của P.anomala thì hoạt tính giảm 1/2 khi ở nhiệt độ
80oC/5phút.
• pH: Hầu hết phytase hoạt động ở pH khoảng 4,5-6,0 và hoạt tính enzyme giảm nhanh ở pH <3,0 hoặc cao hơn 7,5. Một số nấm men sinh phytase pH tối ưu 4,0-5,0.
Nghiên cứu ở một số nấm men sinh phytase ngoại bào và tất cả chúng hoạt động tối ưu ở pH 4,0-5,0 phân tích ở nhiệt độ 50-60oC. Nhiều chủng sản sinh phytase khác ở nhiệt độ 37oC với pH tối ưu 3,0-4,0. Điều này cho thấy rằng có hơn một loại phytase mà cùng loại protein ở pH tối ưu khác nhau tại nhiệt độ khác nhau.
• Sựức chế hoạt tính phytase bởi ion kim loại
Những ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính phytase thì khác nhau
đối với các enzyme phytase. Thí dụ phytase của S.castelli thì bị ức chế 1 phần khi có sự hiện diện của Ca2+, Mg2+, Mn2+, và Fe2+(5mM), còn các ion Zn2+, và Cu2+ (0,5mM) làm giảm 50% hoạt tính enzyme, trong khi đó 5mM Zn2+ và Cu2+ thì gây ức chế hoạt tính enzyme khá cao. Phytase của C.krusei
thì bị ức chế mạnh bởi Zn2+ và Mg2+ (1mM và 5mM), nhưng nó không bị ức chế đáng kể khi có sự hiện diện của Ba2+, và Pb2+. Còn P.anomala thì phytase bị ức chế mạnh bởi Fe3+, Cu2+, Zn2+, và Hg2+.
Ảnh hưởng của những ion kim loại lên hoạt tính phytase Ca2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+, EDTA, nồng độ 0,1mM và 0,5mM.
Ảnh hưởng của các ion khoáng lên hoạt tính phytase có lẽ do nó kìm hãm mạnh khả năng của phytate kế hợp với enzyme kết quả là hình thành cấu trúc phytase-ion kim loại không tan. Tùy theo pH của dung dịch và nồng độ của ion kim loại, phytate có thể tồn tại ở dạng kim loại tự do, hoặc phức hợp phytate-kim loại. Tại pH acid, nhóm phosphate sẽ sinh ra dạng kim loại tự
do, trong khi đó phức hợp phytate-kim loại với ion kim loại hóa trị hai như
Ca2+, Mg2+… sẽđược hình thành ở pH trung tính. • Cơ chất đặc hiệu:
Phytase thường kết hợp với cơ chất đặc hiệu với ái lực cao. Tốc độ
phytase của S.castellii có giá trị Km thấp nhất đối với sự thủy phân cơ chất là phytate. Còn phytase của P.anomala có cơ chất đặc hiệu rộng, như ATP, và p-nitrophenyl phosphate (Vohra và Satyanaraya, 2002a). Tương tự, phytase của C.krusei có cơ chất đặc hiệu rộng, nhưng hoạt tính tối đa khi xúc tác thủy phân với cơ chất là phytate.
• Đặc điểm phân tử:
Phytase có trọng lượng phân tử cao từ 40-500kDa. Trọng lượng phân tử
protein được xác định bằng 10% SDS-PAGE. Phytase của P.anomala có trọng lượng phân tử là 64kDa trong khi đó phytase của nấm men C.krusei có trọng lượng phân tử là 330kDa và có 2 tiểu đơn vị khác nhau. Phytase của
S.castellii có trọng lượng phân tử 490kDa.
Có một số báo cáo về những vị trí hoạt động của các phytase nấm men.
Đối với phytase của P.anomala, thì một cầu nối arginine được cho rằng đóng vai trò quan trọng trong xúc tác, trong khi đó S.castellii, các nhóm SH thì liên quan đến sự xúc tác. Tương tự các nhóm SH cũng tham gia vào trung tâm hoạt động của C.krusei sinh phytase.
Một số gen acid phosphate của nấm men được tìm thấy là có vùng bảo tồn RHGXRXP và dipeptide HD hoạt động xúc tác.
Nhóm này của các enzyme sẽ xúc tác thủy phân acid phytic qua hai bước:
• Một nucleophilic histidine trong vị trí hoạt động của enzyme đến cắt cầu nối phosphoester của acid phytic.
• Tách proton H+ ra khỏi nhóm nhờ cầu nối acid aspartic của motif HD. Một phân tích và so sánh những trình tự này cho thấy có sự hiện diện của 1 motif 8-cystein bảo tồn dường nhưđóng một vai trò quan trọng của cấu trúc HAPhys (Histidine acid phytases). Tuy cầu nối cystein không liên quan trực tiếp đến sự xúc tác nhưng nó đóng vai trò trong sự hình thành cầu nối disulfide S-S, và do đó nó góp phần vào sựổn định và bền nhiệt của phytase (Mullaney và Ullah, 2005).
Bảng 1.3 : Động học của phytase nấm men [15] Nấm men toop (oC) pHop Trọng lượng phân tử (kDa) Km (mM) Ức chế Tác giả Arxula adeninivorans 75 4,5 - 0,25 Mg 2+, Ca2+, Zn2+ Sano et al.,1999 Candida intermedia 65 4,5 - - - Nakamura et al.,2000 C.krusei WZ-001 40 4,6 330 0,03 Zn 2+ , Mg2+, pCMB, PMSF Quan et al.,2002 C.tropicalis 65 4,5 - - - Nakamura et al.,2000 Kluyveromyces thermotolerans 60-65 4-5 - - - Nakamura et al.,2000 Pichia anomala 60 4,0 64 0,2 Fe3+, Hg2+, Zn2+, 2,3- butane dione, Gu- HCl, urea Vohra và Satyanarayana, 2002 P.rhodanensis 70-75 4,0-4,5 - 0,25 - Nakamura et al.,2000 P.spartinae 75-80 4,5-5,5 - 0,33 - Nakamura et al.,2000 Schwanniomyces castellii 77 4,4 490 0,038 ZnpCMB 2+, Cu2+, Segueilha et al.,1992
1.4.6 Con đường khử phosphoryl hóa phytate
Các phytate khác nhau về nguồn gốc thì sản sinh ra các đồng phân myo-inositol riêng biệt với mức độ phosphoryl hóa khác nhau và có những con đường phosphoryl hóa khác nhau. [15]
Hình 1.5 : Các con đường khử phosphoryl hóa của IP6 xúc tác bởi phytase của (A) – C.krusei, (B) –P. rhodanensis và (C) –S. cerevisae
1.4.7 Chế phẩm Myo-inositol
Có sự tăng inositol phosphate và phospholipid khi chúng đóng vai trò quan trọng truyền tín hiệu qua màng tế bào và huy động calcium dự trữ trong nội bào, vì thế nó đạt kết quả cần thiết cho những chế phẩm inositol phosphate khác. Dẫn xuất inositol phosphate cho thấy việc sử dụng chúng như là chất ổn định enzyme, các cơ
chất của enzyme cho các nghiên cứu biến dưỡng khác nhau. Myo-inositol cũng có
ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Số lượng và vị trí của nhóm thì ảnh hưởng rất lớn đến chức năng sinh lý của chúng. [16]
Kết quả của sự thủy phân myo-inositol hexakisphosphate (IP6) bởi phytase sẽ
giải phóng các inositol phosphate khác nhau thấp hơn (IPs), mà nó rất có ích trong nghiên cứu những tác động sinh lý của chúng.
Cốđịnh tế bào của C.krusei trong gel Ca-alginate thì cho các chế phẩm Ips khác nhau và các đồng phân tinh sạch. Sau đó được phân tách bằng sắc ký trao đổi ion.
Phytase của S.cerevisae được sử dụng để sản xuất chế phẩm D-myo-inositol 1,2,6-triphosphate, D-myo-inositol 1,2,5-triphosphate, L-myo-inositol 1,3,4- triphosphate và L-myo-inositol 1,2,3-triposphate (Siren, 1986b).
CÁC ĐỒNG PHÂN INOSITOL
cis-INOSITOL epi-INOSITOL allo-INOSITOL
(CAS RN: 643-10-7) neo-INOSITOL (CAS RN: 488-54- 0) myo-INOSITOL (CAS RN: 87- 89-8) muco-INOSITOL (CAS RN: 41546-34-2) scyllo-INOSITOL (CAS RN: 488-59-5) L-(-)-chiro- INOSITOL (CAS RN: 551-72- 4) D-(+)-chiro-INOSITOL (CAS RN: 643-12-9) Hình 1.6: Các đồng phân inositol [31]
1.4.8 Phân loại Sporobolomyces japonicus [27], [28], [33] Giới: Nấm Ngành: Basidiomycota Lớp: Ustilaginomycetes Bộ: Ustilaginales Họ: Ustilaginaceae Giống: Sporobolomyces
Loài: Sporobolomyces japonicus
1.4.9 Ứng dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi
Thức ăn chăn nuôi chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật và khoảng 2/3 phospho trong thức ăn có nguồn gốc từ thực vật ở dạng phytate phospho.
Sự kết hợp phytase trong thức ăn sẽ làm giảm sự bổ sung phospho vào. Điều này sẽ cải thiện cho quá trình tiêu hóa và có nghĩa là nó có giá trị dinh dưỡng trong thức
ăn chăn nuôi, do đó tốc độ tăng trưởng của động vật có dạ dày đơn như : heo, gà, gia cầm, tăng trưởng đáng kể và cũng làm giảm sự ô nhiễm môi trường gây ra bởi sự loại thải phospho.
Có 2 cách cơ bản sử dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi: • Khả năng đầu tiên là thay thế chất bổ sung Pi bằng phytase.
• Cách thứ 2 của việc sử dụng phytase là tiền xử lý thức ăn chăn nuôi để giảm lượng phytate trong thành phần thức ăn.
Những kết quả thực nghiệm từ các phòng thí nghiệm lớn đã xác định rằng 500- 1000U phytase có thể thay thế khoảng 1g Pi bổ sung và giảm sự thải phospho ra ngoài môi trường 30-50% [13], [16]
1.4.10 Ứng dụng phytase trong thực phẩm
Sự hiện diện của phytase trong thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật thì đã được biết rõ và khá phổ biến. Một lượng lớn dân số có xu hướng bị tác động xấu đến việc thiếu hụt sắt và kẽm do sự hấp thu thực phẩm giàu phytate từ thực vật, và những nghiên cứu trên con người đưa ra rằng sự hấp thu kẽm và sắt từ bữa ăn có sự đối lập với thành phần phytate của nó. Phytase thực phẩm thì bị mất hoạt tính trong quá trình nấu và do đó sự tiêu thụ phytate sẽ kém đi và kết quả là ảnh hưởng đến sự
hấp thu các chất khoáng trong ruột non. Phytase bổ sung có thể đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của con người, và cả việc làm giảm bớt sự mất hoạt tính phytase trong quá trình nấu và trong dạ dày ruột. Việc sử dụng an toàn qua hàng chục năm cũng như vai trò probiotic của chúng, làm cho chúng trở thành một nguồn tốt hơn đối với các vi sinh vật khác.
Một ứng dụng quan trọng khác của phytase trong sản xuất bánh mì là nó được sử dụng để làm giảm thấp thành phần phytin trong bánh mì. Trong tổng lượng bột bánh mì thì phytate hiện diện ở mức 0,29-1,05% (w/w). Mặc dù thông thường lượng phytate trong tổng lượng bột bánh mì giảm 50-60% trong quá trình nướng, và sự giảm này gây nên sự thiếu nước mà nước giúp tăng đáng kể các đặc tính sinh học sẵn có trong chất khoáng.
Một số nghiên cứu hoạt tính phytase trong nấm men nướng bánh và nhiều nhà nghiên cứu nhấn mạnh vai trò của phytase nấm men trong quá trình làm bánh mì. Trong suốt quá trình làm bánh mì, việc giảm hàm lượng phytate được xem là kết quả của quá trình nướng bánh và do hoạt tính của phytase. Việc sử dụng lượng nấm men cao và thời gian lên men dài trong quá trình lên men dài nhằm duy trì lượng chất xơ cao với lượng phytate thấp.
Ngoài ra phytase còn ứng dụng trong sản xuất sữa đậu nành, do trong sữa đậu nành phytate chiếm 0,56%.
Do đó phytase nấm men có lẽ được ứng dụng trong quá trình chế biến thực phẩm để sản xuất thực phẩm chức năng. [16]
1.4.11 Tiềm năng trong ngành thủy sản
Trong nuôi trồng thủy sản, chi phí cho thức ăn lên đến 70% trong toàn bộ chi phí sản xuất. Nhiều nghiên cứu được tiến hành vào việc dùng bã đậu nành hoặc bã thực vật khác trong nuôi trồng thủy sản để thay thế cho protein giá cao hơn như khi dùng cá khô. Tuy nhiên, ảnh hưởng kháng dinh dưỡng của acid phytic là một vấn đề đối với cá do ống tiêu hóa của chúng ngắn, chính điều này gây trở ngại cho việc sử
dụng protein có nguồn gốc từ thực vật làm thức ăn cho cá. Do đó, phytase được
đánh giá như là một chất làm tăng khả năng sử dụng protein thực vật với chi phí thấp trong ngành nuôi trồng thủy sản cũng như duy trì mức độ phospho cho phép ở
trong nước. Nấm men và phytase nấm men có lẽ cải thiện nguồn nước bẩn và nước mặn trong nuôi trồng thủy sản do vai trò probiotic của chúng. [16]
1.4.12 Định hướng tương lai
Nghiên cứu phytase nấm men có thể quan trọng với nhiều nguyên nhân. Do phytase nấm mốc đặc biệt là Aspergillus spp, đã được nghiên cứu khá nhiều do ứng dụng của chúng trong bổ sung vào thức ăn chăn nuôi làm tăng hàm lượng phospho và các khoáng chất. Tuy nhiên, trong thực phẩm cho con người, thì phytase không có sẵn. Nhờ vào khả năng hầu như không gây bệnh, nấm men được chọn làm nguồn sản xuất phytase để ứng dụng trong thực phẩm cho con người. Hơn thế nữa, IP6 là một hợp chất phổ biến trong tự nhiên, nấm men sẽ dễ dàng sử dụng chúng. Do đó hoạt tính thủy phân phytate sẽ rất quan trọng cho nấm men để biến dưỡng phospho và inositol. Khả năng sản sinh phytase đạt giá trị hiệu quả và nghiên cứu mã hóa gen nấm men sinh phytase cũng không được nghiên cứu sâu, vì thế những nỗ lực nghiên cứu nhiều hơn được gọi là khám phá ra các phytase mới từ nguồn nấm men. Từ trước đến nay rất ít loài được biết và để phát triển quá trình sản xuất ở phạm vi rộng lớn. Kỹ thuật sản xuất phytase ra đời để đáp ứng nghiên cứu những đặc điểm về pH, ổn định nhiệt độ, cơ chất đặc hiệu và tốc độ xúc tác cao hơn.
Cho đến bây giờ, chỉ những trình tự sơ khởi của 2 loài nấm men sinh phytase
được nghiên cứu và vì thế cần thiết phải phân lập và giải trình tự các gen sinh phytase của các nấm men khác nhau để hiểu rõ về cấu trúc phân tử 3D, nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng. [16]
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm men Sporobolomyces japonicus được phân lập từ Vườn Quốc Gia Cát Tiên, trong bộ sưu tập của Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM.
2.1.2 Dụng cụ và thiết bịü Bình tam giác ü Bình tam giác ü Bình định mức ü Bình hút chân không ü Cốc đốt ü Đĩa petri ü Đèn cồn ü Đũa thủy tinh ü Giấy lọc ü Ống hút ü Ống nghiệm ü Ống đong
ü Phễu thủy tinh/nhựa ü Phòng đếm hồng cầu ü Que cấy ü Bể ổn nhiệt ü Bếp điện ü Bộ điện di ü Bộ sắc ký lọc gel (Bio- Rad) ü Cân phân tích ü Kính hiển vi quang học ü Lò vi sóng
ü Máy đông khô ü Máy khuấy từ ü Máy lắc ü Máy li tâm ü Máy quang phổ ü Máy sấy chân không ü Máy vortex ü Nồi hấp khử trùng ü pH kế ü Tủ ấm ü Tủ cấy ü Tủ lạnh ü Tủ sấy
2.1.3 Hóa chất và cách pha dung dịch hóa chất
2.1.3.1 Hóa chất
Nhóm vô cơ
Muối
2. Amonium persulphate (NH4)2S2O8 3. Amonium sulphate (NH4)2SO4 4. Calcium clorate CaCl2
5. Copper sulphate CuSO4.5H2O 6. Ferrous sulphate FeSO4/Fe2(SO4)3 7. Magnesium sulphate MgSO4.7H2O 8. Mangansium sulphate MnSO4.H2O
9. Potassium antimony tartrate C8H4K2O12Sb2 .3H2O 10. Potassium clorate KCl
11. Potassium dihydrophosphate KH2PO4 12. Trisodium phosphate Na3PO4
13. Zinc sulphate ZnSO4.7H2O
Acid 14. Acid clohyric đậm đặc 15. Acid phosphoric 16. Acid sulfuric đậm đặc 17. Acid clohydric Nhóm hữu cơ
18. Sodium phytate (Na- phytate)C6H6(OP3Na2)6 19. Calcium phytate (Ca-phytate)
20. Acid ascorbic C6H8O6 21. Acid tricloroacetic (TCA) 22. Acid acetic
23. EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 24. Dung dịch albumin
25. Glycine
26. Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad)
27. Hỗn hợp Acrylamide và Bisacrylamide 30% (BioRad) 28. SDS (sodium dodecyl sulphate)
29. TEMED (N,N,N’,N’- tetramethylene-ethylenediamine)
31. Bromophenol blue (BHD) 32. Dithiothreitol (DTT) 33. Glycerol 34. Ethanol 35. Methanol Dung dịch đệm 37. Đệm acetate 38. Đệm glycine-HCl 39. Đệm Tris-HCl Thuốc thử
40. Coomassive Brilliant blue 41. Thuốc thử Bradford (Bio-Rad)
2.1.3.2 Cách pha các dung dịch hóa chất
v Các hóa chất dùng để xây dựng đường chuẩn phospho và xác
định hoạt độ enzyme
- Đường chuẩn KH2PO4 cho thí nghiệm xác định hoạt độ phytase.
Chuẩn bị 9mM dung dịch phosphate stock: Cân 1,224g KH2PO4 thêm dung dịch đệm acetate pH 5,5 đến 1000ml.
Bảng 2.1: Pha dung dịch phospho chuẩn
Pha loãng 9mM dung dịch phosphate Nồng độ phosphate mM 1:1600 5,625 1:800 11,25 1:400 22,5 1:200 45 1:100 90