v Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở khử Mo (VI) của hợp chất dị đa acid phosphomolypdic H3PO4.12MoO3 với sự tạo thành molyden xanh có màu xanh hay màu xanh thẫm tùy thuộc vào hàm lượng phospho của phức acid phosphomolybdic. Thành phần của phức màu phụ thuộc vào độ acid của môi trường, nồng độ amonium molybdate, tính chất của chất khử cho nên cần thí nghiệm thật nghiêm ngặt.
Những chất khử thường được sử dụng là SnCl2, hydrazin, acid ascorbic, quinon, oxalate, sulfit. [4]
2.2.1.1 Dựng đường chuẩn phospho
Bảng 2.4: Pha đường chuẩn phospho
Ông nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ 0 5,625 11,25 22,5 45 90
phospho mM
Hút 0,2ml mẫu vào các ống nghiệm đã đánh số ở bảng 2.4 cho mỗi nồng độ thực hiện phản ứng màu bằng cách trộn 0,2ml mẫu với 1,8ml nước cất, thêm 2ml thuốc thử màu cho mỗi ống nghiệm và trộn đều. Ủ 50oC trong 15 phút và để ống nghiệm ở nhiệt phòng, đo OD bước sóng 820nm. Sử dụng nước làm ống thử không.
Từ mỗi nồng độ và OD tương ứng của nó, ta vẽ đường chuẩn phospho.
2.2.1.2 Xác định lượng phospho trong dung dịch nghiên cứu
Pha loãng dịch enzyme ở nồng độ phù hợp bằng đệm acetate pH 5,5. Thực hiện phản ứng theo các bước sau:
Bảng 2.5: Các bước xác định hàm lượng phospho [17]
Dung dịch hóa chất Ống thử thật Ống thử không Na- phytate 9mM (ml) 1 1 TCA 15% (ml) 0 2 Dung dịch phytase (ml) 1 0 Trộn đều, ủ 37oC trong 15 phút TCA 15% (ml) 1 0 Dung dịch phytase (ml) 0 1
Trộn đều, hút 0,2ml hỗn hợp phản ứng cho thực hiện phản ứng màu Hỗn hợp phản ứng (ml) 0,2 0,2
Nước cất (ml) 1,8 1,8
Thuốc thử màu (ml) 2 2
Trộn đều,ủ ở 50oC trong 15 phút, để ở nhiệt độ phòng, đo OD ở bước sóng 820nm
Xác định hoạt độ chung
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độphytase được xác định là lượng enzyme cần thiết xúc tác giải phóng 1mmol phospho vô cơ trong 1 phút từ cơ chất là Na-phytate ở 37o
1UI = 1mmol phospho/ml/phút hoặc 1mmol phospho/mg/phút Công thức:
X: số mmol phospho suy ra từ đường chuẩn
2: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng (ml)
v : thể tích hỗn hợp phản ứng đem xác định lượng phospho V: thể tích dịch enzyme đem phản ứng
m: lượng enzyme đem pha loãng K: độ pha loãng mẫu
t : thời gian phản ứng (15 phút)
Xác định hoạt độ riêng
2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein
v Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với xanh Coomassive (Coomassive Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài mg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. [1],[2]
v Cách thực hiện:
Dựng đường chuẩn 1: Sử dụng thuốc thử Bradford của hãng Bio-Rad
Bảng 2.6: Pha đường chuẩn albumin
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ albumin (microgram/ml) 0 1,41 2,82 4,23 5,64 7,05 8,46 9,87 HĐ (UI/g) = X.2.K V.v.m.t
HĐR (UI)= Hoạt độ chung . 1000 (UI/mg)
Hút 2,4ml dung dịch protein pha loãng ở nồng độ thích hợp, thêm 0,6ml thuốc thử Bradford, lắc đều. Sau 10 phút đem đo ở bước sóng 595nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (DOD) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml)
Xác định protein mẫu:
Hút 2,4ml protein mẫu và cho 0,6ml thuốc thử Bradford, lắc đều, để yên 10 phút đem đo OD595nm. Từ đường chuẩn ta suy ra hàm lượng protein cần phân tích.
2.2.3 Phương pháp sắc ký lọc gel:
v Nguyên tắc:
Sử dụng một nguyên liệu có tính chất hạt gel, đưa các hạt gel vào cột. Chuyển dung dịch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất định, khi mở van ở đáy, ta lần lượt thu nhận các phân đoạn khác nhau có trọng lượng phân tử khác nhau.
Các gel được sử dụng chủ yếu hiện nay là sephadex, một dextran (oligosaccharide) được cấu tạo từ nhiều đơn vị a-glucose nối với nhau bằng liên kết 1,2 ; 1,4 ; 1,6 ; 1,3 O-glucoside. Do có nhiều liên kết tạo thành một mạng lưới, sephadex có khả năng hút nước, trương nở. Khi ngâm các hạt gel trong nước thì trong vài giờ sẽ tạo thành hai pha khác nhau:
o Pha mạng: gồm các mạng lưới liên kết trong hạt gel
o Pha loãng: pha nằm giữa các hạt gel và được phủ đầy bởi dung môi hoặc nước.
Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột chứa các hạt gel sephadex trương nở thì xảy ra quá trình tách những phần tử có kích thước trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua một cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel và do đó sẽ di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phần tử nhỏ. Kết quả là tách được các chất có trọng lượng phân tử khác
nhau thành các phân đoạn theo trình tự: Các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn sẽ ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ sẽ ra sau. [1]
Hình 2.1 : Hệ thống sắc ký lọc gel của Bio-Rad.
v Tiến hành thực nghiệm [6]
- Thiết bị và hóa chất
Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 50 x 1,5cm, thể tích 88ml
Biogel P-100 của hãng Bio-Rad là dạng hạt mịn, kích thước hạt 45- 90nm, khả năng ngậm nước là 12ml/g gel khô, phạm vi phân tách là 5000- 150000 daltons.
Đệm acetate 0,2M pH 4,0 khử bọt khí trước khi dùng
- Chuẩn bị gel và nhồi cột
Cân 8g gel khô vào erlen 500ml, cho nước cất từ từ khoảng 250ml. Để qua đêm cho quá trình hydrate hóa xảy ra, sau khi hydrate hóa hoàn toàn chuyển dung dịch vào hệ thống hút chân không để khử khí (khoảng 60 phút)
Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp 2 lần lớp gel nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Loại lớp nổi trên bề
mặt bằng cách hút, lặp lại nhiều lần để loại hầu hết các hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
Gắn phiễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột.
Rót đều dung dịch gel vào cột thành cột dòng di chuyển nhẹ, tránh bọt khí.
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel
Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thề tích lớp nền chảy qua cột đồng thời với việc điều khiển tốc độ dòng chảy.
Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Khi tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị.
- Nạp mẫu chạy sắc ký
Mẫu sau khi tủa bằng dung môi thích hợp, đem sấy khô, cân và hòa vào đệm acetate 0,2M, pH 4,0.
Dùng ống tiêm bơm 2ml mẫu vào cột sắc ký.
Dịch ra khỏi cột được thu tự động vào các ống nghiệm, mỗi phân đoạn 2ml và được đo ở bước sóng 280nm bằng detector trong bộ sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính.
Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành thu các peak và đem xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzyme, điện di SDS-PAGE, xác định trọng lượng phân tử protein.
- Tính toán:
So sánh hoạt độ riêng của enzyme trước và sau khi lọc qua gel
Hoạt độ riêng UI/ml Protein/ml
UI/ml: hoạt độ của 1ml dịch enzyme
Protein/ml: hàm lượng protein của 1ml dịch enzyme
Tính hiệu suất hoạt độ của enzyme và hàm lượng protein thu được
qua lọc gel
HHT%: Phần trăm hiệu suất hoạt độ enzyme V: Tổng thể tích enzyme cho vào lọc gel X: Hoạt độ của enzyme cho vào lọc gel V1: Tổng thể tích của peak 1
X1: Hoạt độ của peak 1 V2: Tổng thể tích của peak 2 X1: Hoạt độ của peak 2
HP%: Phần trăm hiệu suất protein của enzyme V: Tổng thể tích enzyme cho vào lọc gel
Y: Hàm lượng protein của enzyme cho vào lọc gel V1: Tổng thể tích của peak 1
Y1: Hàm lượng protein của peak 1 V2: Tổng thể tích của peak 2 Y1: Hàm lượng protein của peak 2
2.2.4 Phương pháp điện di SDS PAGE
v Nguyên tắc:
Các protein được phản ứng với các chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để tạo thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithithreitol (DTT) để phá vỡ cầu nối
HHT % V1.X1 + V2.X2 +…. V.X
HP% V1.Y1 + V2.Y2 +…. V.Y
S-S- (disulfur) của protein và các tiểu đơn vị của chúng. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ.
Mục đích của phương pháp điện di là để đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử chuẩn là hỗn hợp protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.
Tốc độ di chuyển của protein trong phương pháp điện di phụ thuộc vào: § pH của môi trường (pH môi trường làm thay đổi điện tích của phân tử protein do đó phải dùng dung dịch đệm để duy trì một pH ổn định)
§ Hình dáng và trọng lượng phân tử § Cường độ điện trường
§ Nhiệt độ
§ Tính chất của giá mang (giấy, acetate, cellulose, gel) sẽ ảnh hưởng ít nhiều đến sự di chuyển của protein.
Lớp gel gom mục đích làm cho các protein trong mẫu được dồn lại thành băng mỏng, lớp gel phân tách sẽ tạo ra các băng protein có kích thước khác nhau từ cùng một điểm xuất phát. [2]
v Tiến hành thí nghiệm
hộp điện di, dụng cụ làm gel (tấm kính, lược kẹp, micropipet).
- Thao tác lắp gắn khung gel vào:
Sau khi lau các tấm kính bằng ethanol 70%, thì lắp kính vào khung gel.
- Chuẩn bị đổ gel:
Gel phân tách (Separating gel)12%
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào các cốc thủy tinh 50ml Acrylamide/Bisacrylamide 30% : 4ml
Separating gel buffer pH 8,8 : 2,5ml
Nước cất : 3,445ml
TEMED : 5ml
Amonium persulfate 10%: 50ml
Dùng pipetman trộn đều hỗn hợp gel, sau đó bơm dung dịch vào khuôn đổ gel sao cho gel cách mép của tấm kính khoảng 2cm, nhẹ nhàng cho một lớp nước cất lên trên lớp gel vừa đổ để quá trình polymer hóa xảy ra.
Gel gom (Stacking gel) 5%
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc thủy tinh 50ml Acrylamide/Bisacrylamide 30%: 0,67ml
Stacking gel buffer pH 6,8: 1ml
Nước cất : 2,3ml
TEMED : 4ml
Amonium persulfate 10%: 20ml
Sau khi gel phân tách đã polymer hóa hoàn toàn (khoảng 30-45 phút), hút hết lớp nước bên trên. Và tiếp tục dùng pipetman đổ từ từ lớp gel gom vào, đưa lược vào gel để tạo các giếng. Đợi khoảng 30 phút để gel polymer hóa, nhẹ nhàng lấy lược ra, loại bỏ phần gel acrylamide thừa bằng cách dùng khăn giấy thấm cho sạch và lắp đĩa gel vào bộ điện di, đổ dung dịch đệm điện di vào buồng điện di sao cho vừa ngập qua khuôn gel.
- Xử lý mẫu
Hút 40ml protein mẫu và thêm 10ml đệm pha mẫu 5x vào trong 1 eppendof.
Đun nóng 100o
Ly tâm 130000vòng/phút trong 30 giây
- Nạp mẫu
Cho đệm điện di vào buồng điện di
Dùng pippetman hút mẫu cho nhẹ nhàng vào giếng, mỗi giếng nạp 20ml mẫu. Lượng protein tối đa cho mỗi giếng là 20-40mg.
Cẩn thận tránh bọt khí xuất hiện trong quá trình bơm mẫu vào giếng.
- Chạy điện di
Đậy hộp điện di cắm 2 đầu điện cực vào nguồn điện, chỉnh cường độ dòng điện 110mA. Thời gian điện di khoảng 60-90 phút. Sau khi front nhuộm chạy đến cuối miếng gel, tắt nguồn điện và lấy tấm gel ra.
- Nhuộm màu sau điện di SDS-PAGE
Lấy gel ra và cho vào một hộp nhỏ chứa 30ml thuốc nhuộm Coomassive. Đậy nắp lại và đặt hộp trên máy lắc nhẹ trong vòng 30 phút.
- Giải nhuộm
Sau khi nhuộm xong, đổ thuốc nhuộm và rửa nước cho miếng gel vài lần.
Cho khoảng 60ml thuốc giải nhuộm vào hộp chứa gel, giải nhuộm trong 60 phút và ta có thể thấy các vạch protein.
Dùng nước cất cho vừa đầy qua mặt gel và để lắc nhẹ qua đêm, để giải nhuộm hoàn toàn.
* Lưu ý: khi thao tác phải đeo găng tay để tránh dấu vân tay trên gel đồng thời tránh thuốc nhuộm dính vào tay.
- Xác định trọng lượng phân tử của protein [12]
Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad) gồm các protein chuẩn có kích thước xác định như sau:
Phosphorylase b 97.400 Daltons Bovine serum albumin 66.200 Daltons Ovalbumin 45.000 Daltons Carbonic anhydrase 31.000 Daltons Chất kìm hãm trypsin từ đậu nành 21.500 Daltons
Tiến hành đo khoảng cách di chuyển của các protein trong thang chuẩn, protein mẫu (phytase), và đo khoảng cách di chuyển phẩm nhuộm (bromophenol blue). Khoảng cách di chuyển được đo từ đầu gel phân tách cho đến mép của vạch protein.
Tính toán giá trị Rf
Tính lg của trọng lượng phân tử các protein chuẩn đã biết, vẽ đồ thị tương quan giữa lg trọng lượng phân tử của protein thang chuẩn với Rf.
Dựa vào đường chuẩn ta sẽ xác định trọng lượng phân tử protein chưa biết (phytase) nhờ vào giá trị Rf của nó.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Hoạt hóa và giữ giống
2.3.1.1 Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng
Hoạt hóa các chủng nấm men trong môi trường tăng sinh YM. Sau 24 hoặc 48 giờ, dùng que cấy lấy một vòng môi trường cấy ria trên đĩa petri chứa môi trường YMA ủ ở nhiệt độ phòng 2 ngày, sau đó lấy khuẩn lạc đặc trưng cấy vào ống thạch nghiêng bảo quản trong tủ lạnh 2- 4oC, sau 2 tuần cấy chuyền 1 lần.
2.3.1.2 Bảo quản giống trong môi trường lỏng YPD 20% glycerol
Cách 1: Hoạt hóa các chủng nấm men trong môi trường tăng sinh YM. Sau 24 hoặc 48 giờ, thu sinh khối từ môi trường tăng sinh bằng cách ly tâm vô trùng. Dùng pippetman bơm môi trường bảo quản giống vào các eppendof chứa sinh khối vi sinh vật. Sau đó bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ -20oC.
Cách 2: Sau khi hoạt hóa chủng nấm men trong môi trường tăng sinh và cấy khuẩn lạc đặc trưng vào ống thạch nghiêng để từ 1-2 ngày cho khuẩn lạc mọc đều trên ống. Để thu sinh khối ta lần lượt bơm môi trường bảo quản vào ống thạch nghiêng, trộn đều dung dịch chứa sinh khối, và hút vào các eppendof, bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ -20oC
Khoảng cách di chuyển của protein Khoảng cách di chuyển của phẩm nhuộm Rf =
2.3.2 Chọn giống vi sinh vật sinh phytase
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng thủy giải đặc hiệu phytate của phytase, khi chủng nấm men sinh tổng hợp phytase chúng sẽ tiết phytase vào môi trường phân giải Ca-phytate làm trong môi trường. Dựa vào vòng phân giải ta sẽ biết được chủng đó có sinh phyatse hay không .
Cấy các chủng nấm men trên môi trường thạch Schopfer (Ca-phytate), ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 2-3 ngày quan sát có vòng phân giải xuất hiện xung quanh khuẩn lạc hay không, nếu có thì chủng nấm men đó có khả năng sinh phytase còn ngược lại thì không
2.3.3 Thu nhận dịch chiết thô enzyme
Sau thời gian lên men trong môi trường nuôi cấy, thu dịch chiết thô bằng cách ly tâm dịch môi trường 6000 vòng/5 phút, loại bỏ sinh khối, dịch thu được đem lọc qua giấy lọc. Ta thu được dịch enzyme thô.
Ghi chú: Để hoạt độ enzyme ít bị mất đi trong quá trình ly tâm, thì trước khi ly tâm nên cho các bình erlen chứa dịch lên men vào trong tủ lạnh.
2.3.4 Xác định hoạt độ phytase của các chủng nấm men có vòng