Quả chanh dây được chế biến làm thức ăn tương đối dễ dàng. Khi ăn tươi chỉ cần cắt đôi theo bề dọc và dùng thìa để xúc phần thịt có lẫn hạt. Tại Australia, phần
CHƢƠNG 1. TỔNG U N T I IỆU
37
thịt có cả hạt được ăn với đường và kem hay trộn vào salad, yogurt hay dùng làm nước uống. Tại các nơi khác, phần thịt được bọc trong 2 lớp vải thô và ép qua một máy ép để loại hạt. Dịch ép thu được, hay nước cốt tự nhiên có thể thêm đường để tạo vị ngọt hay pha loãng với nước, hoặc với nước ép từ các loại trái cây khác (thích hợp nhất là pha với nước cam hay nước dứa) để làm nước giải khát. Tại Nam Phi, nước ép chanh dây được pha trộn với sữa và thạch từ rong biển [46].
Dịch ép từ quả dây mát có thể đun cô đặc thành một dạng si-rô để sau đó dùng làm nước sốt, món thạch tráng miệng, kẹo, kem, làm nhân bánh…hay pha trộn trong các loại cocktail. Phần thịt có hạt được chế biến thành thạch, hay trộn với dứa (thơm) hay cà chua để làm mứt [46].
Nhiều quốc gia trên thế giới đã sử dụng phần vỏ và tách riêng hạt để dùng trong công nghiệp. Tuy trong phần vỏ của quả chanh dây chỉ có khoảng 2,4 % pectin nhưng tại Fiji, mỗi năm các nhà sản xuất đã thu hồi được đến 5 tấn pectin giúp giảm lượng chất thải. Phần còn lại chứa khoảng 5-6 % protein, được dùng làm chất độn thêm trong thực phẩm cho gia súc và gia cầm. Tại Hawaii, pectin không được thu hồi, nên phần vỏ được băm vụn, sấy khô rồi trộn với mật mía hay ủ chua để làm thức ăn chăn nuôi bò, heo.
Hạt chanh dây cung cấp khoảng 23% dầu, có dạng tương tự như dầu hướng dương và dầu đậu nành, có thể dùng nấu ăn và có thể dùng trong kỹ nghệ sơn, véc ni. Mỗi năm các nhà máy ở Fiji ép được đến 13.000 lít dầu. Phần bã còn lại tuy chứa đến 12% protein và 50- 55% chất xơ nhưng không thích hợp để làm thức ăn chăn nuôi gia súc [46].
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
38
2.1. Trang thiết bị, hóa chất, vật liệu 2.1.1. Trang thiết bị
Tủ cấy, đĩa Petri, ống nghiệm, erlen (250ml, 500ml), bercher (100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), pipette (1ml, 5ml, 10ml), tủ ủ kỵ khí, autolave, máy đo OD, máy ly tâm, tủ sấy, lame, que cấy, que trang, đèn cồn, cân, phễu, đũa khuấy…
2.1.2. Hóa chất
Glucose, pepton, cao nấm men, K2HPO4, CH3COONa, Triamonium citrate, cồn, MgSO4.7 H2O, MnSO4.H2O, agar, gelatin, alginate, dung dịch NaOH (0,1N), thuốc thử phenolphtalein 1%, muối NaCl, sodium alginate, CaCl2, dung dịch HCl, pepsin, muối mật, Na2CO3, NaHCO3, thuốc nhuộm violet, idoine, fusine…
2.1.3. Vật liệu
Giống vi khuẩn Bifidobacterium longum có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống vi sinh vật của Phòng thí nghiệm vi sinh vật, Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.
Cách thu dịch chanh dây: lựa những quả chanh dây vỏ ngoài hơi nhăn, rửa sạch, cắt quả làm đôi, dùng muỗng nạo khối ruột quả màu vàng, ủ với enzyme pectinase (Sigma), hàm lượng 0,25%, trong 3 giờ, nhiệt độ 40-450C. Sau đó tiến hành dùng khăn mịn nhiều lớp lọc thu dịch.
2.2. Nội dung thí nghiệm
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 39 Vi khuẩn Bifidobacterum longum Thực hiện vi gói vi khuẩn B.longum
Đánh giá hiệu quả vi gói
-Khảo sát sự tồn tại của B.longum
trong hạt vi gói trên môi trường dạ dày nhân tạo (SGJ) pH= 2
-Khảo sát sự tồn tại của B.longum
trong hạt vi gói trên môi trường muối mật (0,3%)
Thu sinh khối tế bào Tăng sinh trên môi
trường MRS
Khảo sát hoạt tính probiotic của chủng B.longum
- Khả năng chịu acid dạ dày
- Khả năng chịu enzyme pepsine
- Khả năng chịu muối mật
- Khả năng sinh bacteriocin
Thu hạt vi gói
Lên men bằng
B.longum tự do
Lên men trong điều kiện tối ưu Dịch chanh dây
Khảo sát các điều kiện lên men
Khảo sát tỉ lệ nước bổ sung
Nước chanh dây lên men
Khảo sát thời gian bảo quản
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
40
2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm
2.2.2.1. Hoạt hóa, tăng sinh và giữ giống vi khuẩn B.longum
- Pha chế môi trường MRS broth và môi trường MRS-agar.
- Cấy giống vi khuẩn B. longum vào các ống nghiệm chứa sẵn 10ml môi trường MRS lỏng (pH = 6.5-7) để hoạt hóa giống. Đem ủ kị khí ở 37-420
C trong 1-2 ngày.
- Hút 1ml giống từ các ống nghiệm giống đã hoạt hóa vào các ống nghiệm chứa sẵn 10ml môi trường MRS lỏng để tăng sinh, thu sinh khối tế bào. Đem ủ ở 37-420C trong 1-2 ngày.
- Hút 1ml giống vi khuẩn B. longum từ ống nghiệm đã hoạt hóa cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng để tiến hành pha loãng mẫu ra các nồng độ từ 10-1 đến 10-7. Hút 0,1 ml dung dịch ở các độ pha loãng phối vào đĩa Petri chứa sẵn môi trường MRS-agar đã hấp khử trùng, tiến hành trải đĩa, đem ủ ở 37-420
C từ 1-2 ngày. Sau đó chọn những khuẩn lạc đặc trưng cấy ria trên môi trường MRS-agar trong ống thạch nghiêng, ủ ở 37-420
C từ 1-2 ngày, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 4-50C để làm nguyên liệu giữ giống.
2.2.2.2. Khảo sát sinh học giống vi khuẩn Bifidobacterium longum
a. Quan sát vi thể, đại thể vi khuẩn B.longum
Quan sát đại thể vi khuẩn bằng phương pháp cấy trải: hút 1 ml giống vi khuẩn
B.longum từ ống nghiệm đã hoạt hóa cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước muối
sinh lý đã hấp khử trùng để tiến hành pha loãng mẫu thành các nồng độ từ 10-1 đến 10-7. Hút 0,1 ml dung dịch ở các độ pha loãng phối vào đĩa Petri chứa sẵn môi trường MRS-agar đã hấp khử trùng, tiến hành trải đĩa, đem ủ ở 370
C. Sau 24-48 giờ quan sát và mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn B.longum.
Quan sát vi thể vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram: Thực hiện tiêu bản giọt ép từ canh trường trong các môi trường MRS broth có giống vi khuẩn đã tăng sinh. Sau khi có tiêu bản giọt ép, chúng tôi thực hiện nhuộm Gram để quan sát đại thể vi khuẩn B. longum.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
41
b. Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng B. longum bằng phương pháp đo mật độ quang
Phương pháp đo mật độ quang thường được áp dụng để xác định đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong quá trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm và trong thực tiễn sản xuất [4]. Khi một pha lỏng chứa nhiều phần tử không tan sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. do vậy, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 600-610nm.
Trước tiên, ta cần xây dựng một đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào, bằng cách:
- Pha loãng một huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm định có mật độ bất kỳ thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số liệu.
- Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc, xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.
- Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log(N/ml) theo OD610nm. Xác định khoảng tuyến tính giữa log(N/ml) và OD610nm.
Để xác định mật độ tế bào của dịch huyền phù X, ta tiến hành đo OD610nm
của huyền phù X, từ trị số OD610nm đo được, dựa vào đường tương quan giữa log(N/ml) và OD610nm ta suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml của mẫu [6].
2.2.2.3. Khảo sát hoạt tính probiotic của chủng B. longum
a. Đánh giá khả năng sống trong môi trường có pH thấp.
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường MRS broth có pH khác nhau (từ pH 1,5-3,5), ở 370C trong các khoảng thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
42
Sau đó, hút 0,1 ml dịch nuôi cấy cấy trải trên môi trường MRS agar và ủ ở 370C, từ 24-48 giờ. Đếm, xác định số lượng khuẩn lạc trên các đĩa Petri.
b. Đánh giá khả năng sống trong môi trường có muối mật
Khả năng sống trong môi trường có muối mật của các chủng vi sinh vật được kiểm tra bằng cách ủ tế bào trong môi trường MRS broth chứa 0,3% muối mật ở 370C trong các khoảng thời gian 0, 30, 60, 90,120 phút. Sau đó, hút 0,1ml trải trên môi trường MRS-agar, pH= 6,5-7, ủ ở 370C, 24-48 giờ. Khả năng này được đánh giá dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa Petri.
c. Đánh giá khả năng sống trong môi trường có pepsine
Nuôi cấy chủng B. longum qua đêm trên môi trường MRS. Ly tâm thu sinh khối. Rửa tế bào bằng NaCl 0,85%. Sau đó tái huyền phù trong dịch PBS chứa 5 g/lít pepsine. Khả năng chịu pepsin của chủng vi sinh vật được đánh giá dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được trên môi trường MRS sau khi ủ 370
C trong các khoảng thời gian 0 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút.
d. Đánh giá khả năng sinh bacteriocin
Khả năng sinh bacteriocin của chủng vi sinh vật kiểm định đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị được xác định theo phương pháp khuếch tán trên thạch, thực hiện như sau:
Chủng vi sinh vật kiểm định được nuôi cấy trong 50ml môi trường MRS ở 370C, trong 24 giờ. Sau đó, dịch nuôi cấy được ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C, thu nhận dịch nổi. Điều chỉnh pH dịch nổi đến 6,5 bằng NaOH 1N. Sử dụng dịch nổi này như bacteriocin thô, đem kiểm tra khả năng đối kháng như sau
Sử dụng 10 μl chủng vi sinh vật chỉ thị đã nuôi cấy qua đêm cấy trải trên các đĩa môi trường NA agar. Sau đó, sử dụng các ống thép đã được vô trùng khoan các lỗ đường kính 5mm trên các đĩa thạch. Dịch bacteriocin thô được cho vào các lỗ thạch với thể tích 70 μl. Các đĩa thạch được ủ ở 370C, trong 24 giờ.
Khả năng kháng khuẩn của chủng vi sinh vật kiểm định được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xuất hiện xung quanh lỗ thạch [2].
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
43
2.2.2.4. Vi gói tế bào vi khuẩn B.longum
a. Điều chế nguyên liệu vi gói
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng gelatin làm nguyên liệu vi gói chính v gelatin không độc đối với vi khuẩn và cơ thể người, được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm và y học ở các nước, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào, dễ dàng bị thủy giải trong môi trường dạ dày- ruột để phóng thích tế bào.
Do dung dịch gelatin là chất tạo gel dễ tan ở nhiệt độ thường (khoảng 35- 400C trở lên) nên để khắc phục nhược điểm của gelatin, chúng tôi kết hợp gelatin với alginate tạo hỗn hợp vi gói, trong đó gelatin đóng vai trò làm chất vi gói chính, còn alginate đóng vai trò làm chất chịu nhiệt, giúp vi gói chịu được nhiệt độ cao trên 400C.
Chúng tôi tiến hành khảo sát dung dịch gelatin ở các nồng độ 6%, 8%, 10%, 12% kết hợp với alginate 2%. Đồng thời khảo sát các nồng độ alginate 2%, 3% với nồng độ gelatin hiệu quả nhất.
b. Tạo chế phẩm vi gói bằng phương pháp nhũ tương
Sơ đồ 2.2. Tạo hạt vi gói b ng phƣơng pháp nh tƣơng hóa
Phối trộn Phá hệ nhũ tương để tạo hạt Tạo hệ nhũ tương Rửa, ly tâm Dầu ăn Tween 80 CaCl2 Hỗn hợp gel (gelatin - alginate) Giống vi khuẩn B.longum Hạt vi gói
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
44
Điều chế hỗn hợp gel gelatin- alginate, dung dịch tạo gel CaCl2 0,1M để lạnh, dung dịch glucose 5% để lạnh. Sau khi thu sinh khối tế bào, tiến hành phối trộn với hỗn hợp tạo gel ở các nồng độ khác nhau. Sau đó lắc đều với chế độ 200 vòng/ phút trong 15 phút. Tiếp tục cho dầu ăn kết hợp với Tween 80 vào hỗn hợp và lắc 200 vòng/ phút để hệ nhũ tương đồng đều. Tiếp theo, ta cho thêm CaCl2 0,1M để phá hệ nhũ tương tạo hạt. Rửa hạt vi gói và ly tâm thu hạt. Bảo quản hạt trong dung dịch glucose 5% ở 50C.
2.2.2.5. ánh giá chất lƣợng hạt vi gói
a. Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B.longum trong hạt vi gói trên môi trường dạ dày nhân tạo (SGJ) pH=2
Hiệu quả của vi gói liên quan đến việc duy trì khả năng tồn tại của vi khuẩn lactic trong hạt vi gói, chống lại các yếu tố bất lợi của môi trường.
Các chế phẩm vi gói được tạo ra theo các nồng độ gelatin và alginate sẽ được khảo sát khả năng tồn tại trong môi trường dạ dày nhân tạo (SGJ) pH=2, ở 370C tương tự môi trường dạ dày cơ thể người trong thời gian 30, 60, 90 phút, là các mốc thời gian được sử dụng để đánh giá hiệu quả vi gói vi khuẩn probiotic [13].
Khảo sát mật độ tế bào tại thời điểm ban đầu: Tiến hành cân 1g tế bào vi gói, sử dụng đệm phosphate để phá hạt vi gói. Sau đó tiến hành pha loãng mẫu đến 10-7 và tiến hành cấy trải trên đĩa petri để xác định mật độ tế bào vi gói ban đầu.
Khảo sát trong môi trường dạ dày nhân tạo (SGJ) ở pH=2: Chuẩn bị môi trường dạ dày nhân tạo (SGJ) có pH=2 được hấp thanh trùng ở 900C trong 20 phút. Sau đó tiến hành cân 1g tế bào vi gói và lượng tế bào tự do sao cho số lượng tế bào 2 nghiệm thức là tương đương. Cho lần lượt tất cả vào trong môi trường SGJ pH=2. Sau các khoảng thời gian 30 phút, 60 phút và 90 phút, thu hạt vi gói và phá mẫu bằng đệm phosphate, sau đó pha loãng mẫu và tiến hành trải đĩa để xác định mật độ tế bào còn tồn tại trong môi trường dạ dày nhân tạo so với mật độ tế bào ban đầu.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
45
b. Khảo sát khả năng sống của vi khuẩn B.longum trong hạt vi gói trên môi trường chứa 0,3% muối mật.
Ngoài khả năng chịu được pH thấp của dạ dày thì khả năng chịu muối mật cũng là một tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả của vi khuẩn probiotic. Do đó, để đánh giá được vai trò của vi gói trong bảo vệ vi khuẩn probiotic chống lại các yếu tố bất lợi của môi trường thì việc khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B.longum trong môi trường có nồng độ muối mật 0,3% là điều cần thiết.
Khả năng tồn tại của vi khuẩn B.longum trong môi trường có muối mật được kiểm tra bằng cách ủ hạt vi gói trong môi trường MRS broth chứa 0,3% muối mật ở 370C trong 120 phút. Sau các khoảng thời gian 0, 30, 60, 90,120 phút, chúng tôi tiến hành thu hạt vi gói và phá mẫu bằng đệm phosphate, sau đó pha loãng mẫu và tiến hành trải đĩa để xác định mật độ tế bào còn tồn tại trong môi trường muối mật so với mật độ tế bào ban đầu.
2.2.2.6. Khảo sát điều kiện lên men dịch ép chanh dây
Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm để xác định các điều kiện lên men theo phương pháp thực nghiệm lâu dài. Đây là phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật. Trên cơ sở hiểu biết về sinh lý vi sinh vật, người ta xác định tính chất