3.2.1. Khả năng sống trong môi trƣờng có pH thấp
Zhou và cộng sự (2007) cho rằng khoảng giá trị pH từ 2÷3 được xem là khoảng pH quyết định để sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng s dụng làm probiotic [57]. Dùng phương pháp cấy trải để xác định mật độ tế bào tồn tại qua các thời điểm khác nhau trong môi trường có pH thấp, kết quả được thể hiện ở đồ thị 3.2.
Qua độ thị 3.2 cho thấy nếu cho mật độ tế bào ban đầu là 100% thì trong môi trường pH=1,5, số lượng tế bào vi khuẩn B. longum chỉ còn khoảng 72,27% so với số lượng tế bào ban đầu sau 30 phút khảo sát, sau 60 phút khảo sát số lượng tế bào
B. longum giảm xuống còn 64,17% và sau 120 phút khảo sát tế bào vi khuẩn chỉ còn khoảng 25,01%. Trong khi đó, ở môi trường pH=2, mật độ vi khuẩn còn 72,75% sau 30 phút, sau 60 phút còn lại 66,32% tế bào vi khuẩn hiện diện và sau 120 phút, số lượng vi khuẩn còn lại 41,17%. Ở môi trường pH=2,5, số lượng tế bào vi khuẩn tồn tại cao hơn ở môi trường pH 2 với lượng tế bào vi khuẩn tồn tại ở mức lần lượt là 88,15%, 73,10% và 56% sau 30 phút, 60 phút và 120 phút. Ở các môi trường có pH=3 và pH=3,5, vi khuẩn B. longum còn tồn tại lớn hơn 70% sau 120 phút th nghiệm, cụ thể là 71,62% ở môi trường pH=3 và 74,27% ở môi trường
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
54
pH=3,5. Số liệu chi tiết của kết quả khảo sát mật độ tế bào B. longum tồn tại trong môi trường pH thấp được trình bày trong bảng 3.1 và bảng 3.2 phần phụ lục.
Như vậy, qua kết quả khảo sát sự tồn tại trong môi trường pH thấp cho thấy chủng B. longum có tiềm năng được s dụng làm probiotic bởi khả năng tồn tại từ 41,17% đến 71,62% trong khoảng pH từ 2÷3 sau 120 phút khảo sát.
3.2.2.Khảo sát khả năng tồn tại trong môi trƣờng pepsin
Theo Holzapfel và cộng sự (1998), pH thấp của dạ dày và hoạt tính kháng vi sinh vật của pepsin được xem là rào cản hữu hiệu chống lại sự xâm nhiễm của các vi khuẩn vào đường tiêu hóa [28]. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B. longum trong môi trường chứa 5 g/l pepsin, kết quả được trình bày ở đồ thị 3.3.
Khi x lý bằng pepsin (5 g/l) chủng B. longum có xu hướng giảm dần tỉ lệ sống theo thời gian. Sau 30 phút x lý, chỉ còn khoảng 83,11% tế bào tồn tại so với mật độ ban đầu. Sau 60 phút x lý, mật độ tế bào vi khuẩn tiếp tục giảm, chỉ còn khoảng 71,22% và sau 120 phút, chỉ còn khoảng 47,58% lượng tế bào so với mật độ tế bào ban đầu. Số liệu chi tiết của kết quả khảo sát mật độ tế bào B. longum tồn tại trong môi trường chứa 5 g/l pepsin được trình bày trong bảng 3.3 phần phụ lục.
Đồ thị 3.3. % tế bào tồn tại trong môi trƣờng có pepsin (5g/l) so với mật độ ban đầu
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
55
Như vậy, chủng B. longum có khả năng chịu đựng được pepsin nhưng khả năng chịu đựng không cao, do vậy cần có biện pháp bảo vệ tế bào cũng như nâng cao khả năng sống sót của vi khuẩn B. longum khi đi qua dạ dày của người và động vật.
3.2.3. Khảo sát khả năng tồn tại trong môi trƣờng muối mật
Ruột non và đại tràng của người và động vật có chứa nồng độ muối mật tương đối cao và nồng độ này có thể ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật. Do đó, để đảm bảo hiệu quả của các chủng vi khuẩn probiotic thì các chủng vi khuẩn này phải tồn tại và phát triển ở nồng độ muối mật từ 0,15÷0,3% [24].Trong nghiên cứu này, chúng tôi s dụng nồng độ muối mật là 0,3%, được xem là nồng độ để sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng chịu được muối mật [21]. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của vi khuẩn B. longum trong môi trường chứa 0,3% muối mật được trình bày ở đồ thị 3.4.
Kết quả khảo sát cho thấy, nồng độ muối mật 0,3% có tác động bất lợi đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B. longum. Sau 60 phút khảo sát, mật độ tế bào B. longum còn khoảng 82,52% so với mật độ tế bào ban đầu. Sau 90 phút khảo sát, lượng vi khuẩn B. longum tiếp tục giảm, còn khoảng 66,87% và chỉ còn
Đồ thị 3.4. % tế bào tồn tại trong môi trƣờng chứa 0,3% muối mật so với mật độ ban đầu
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
56
khoảng 57,86% sau 120 phút khảo sát. Số liệu chi tiết của kết quả khảo sát mật độ tế bào B. longum tồn tại trong môi trường chứa 0,3% muối mật được trình bày trong bảng 3.4 phần phụ lục.
Như vậy, tuy mật độ tế bào B. longum giảm dần thoe thời gian khảo sát, nhưng sau 2 giờ mật độ vi khuẩn B. longum còn tồn tại trên 50%, chứng tỏ vi khuẩn
B. longum có khả năng tồn tại được trong môi trường chứa 0,3% muối mật.
3.2.4. Khảo sát khả năng kháng khuẩn
Một trong những đặc tính quan trọng làm căn cứ tuyển chọn các chủng vi khuẩn probiotic là khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm định. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn B. longum được trình bày ở đồ thị 3.5.
Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn cho thấy chủng B. longum có khả năng kháng lại tất cả các chủng vi khuẩn kiểm định. Tuy nhiên, mức độ kháng các vi khuẩn kiểm định rất khác nhau, trong đó vòng kháng khuẩn có đường kính lớn nhất đối với chủng Bacillus subtilis (16,2 mm). Số liệu chi tiết của kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của B. longum được trình bày trong bảng 3.5 phần phụ lục.
Đồ thị 3.5. Khả năng kháng khuẩn của chủng B. longum đối với các chủng vi khuẩn kiểm định
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
57
Như vậy, kết quả khảo sát một số hoạt tính probiotic của chủng B. longum cho thấy, chủng B. longum tồn tại được trong môi trường có pH 2÷3 (khoảng từ 41,17-71,62%), cũng như trong môi trường chứa 5 g/l pepsine (khoảng 47,58%), 0,3% muối mật (khoảng 57,86%) sau 120 phút thử nghiệm, và có thể kháng lại các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) như E. coli, Salmonella, Bacillus…nên chủng B. longum có tiềm năng được sử dụng làm probiotic. Để nâng cao khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn này trong điều kiện c c đoan của hệ tiêu hóa, chúng tôi đề uất tiến hành vi gói vi khuẩn trong hỗn hợp vật liệu gelatin và alginate giúp bảo toàn và nâng cao khả năng chống chịu của chủng đối với các điều kiện khắc nghiệt trong hệ ti u h a của người và động vật.
3.3. Thực hiện vi gói vi khuẩn B. longum
Qua qua trình lựa chọn loại vật liệu cũng như nồng độ thích hợp cho vi gói, chúng tôi quyết định chọn gelatin làm vật liệu vi gói chính vì những ưu điểm của nó như gelatin không độc đối với vi khuẩn và cơ thể người, được s dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm và y học ở các nước, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào, dễ dàng bị thủy giải trong môi trường dạ dày-ruột để phóng thích tế bào. Tuy nhiên, do nhược điểm của dung dịch gelatin là dễ tan ở nhiệt độ thường (khoảng 400C trở lên) nên để khắc phục nhược điểm của gelatin, chúng tôi kết hợp gelatin với alginate để tạo hỗn hợp vi gói, trong đó gelatin đóng vai trò làm chất vi gói chính,
Hình 3.3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của B. longum đối với
Bacillus subtilis (a) (b)
ĐC
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
58
còn alginate đóng vai trò làm chất chịu nhiệt, giúp vi gói chịu được nhiệt độ cao trên 400C.
Khi tiến hành khảo sát dung dịch gelatin ở các nồng độ 6%, 8%, 10%, 12% kết hợp với alginate ở các nồng độ 2%, 3%, chúng tôi nhận thấy rằng dung dịch gelatin ở nồng độ trên 10% có khả năng tạo vi gói. Nồng độ gelatin thấp (6%, 8%) ảnh hưởng đến quá trình hình thành hạt vi gói do hạt vi gói quá mềm, không thể tách rời nhau mà dính với nhau thành dạng sợi và khả năng vi gói không đồng đều khi quan sát dưới kính hiển vi. Như vậy chúng tôi chỉ thực hiên vi gói với 4 nghiệm thức: gelatin 10% - alginate 2%; gelatin 10% - alginate 3%; gelatin 12% - alginate 2% và gelatin 12% - alginate 3%.
Bảng 3.6. Một số tính chất hạt vi gói vi khuẩn B. longum
STT Một số tính chất Nhận xét
1 Phương pháp vi gói Phương pháp nhũ hóa với hỗn hợp vật liệu
gelatin - alginate
2 Các dạng chế phẩm vi gói Nghiệm thức 1: Gelatin 10% - Alginate 2%
Nghiệm thức 2: Gelatin 10% - Alginate 3%
Nghiệm thức 3: Gelatin 12% - Alginate 2%
Nghiệm thức 4: Gelatin 12% - Alginate 3%
3 Tính chất cơ lý Hạt vi gói mềm
4 Hình dạng Vi gói có dạng hạt
5 Mật độ tế bào 0,95x109 - 1,46x109 tế bào/g
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
59
3.4. Khảo sát chất lƣợng hạt vi gói
Mục tiêu quan trọng nhất của phương pháp vi gói là bảo toàn và nâng cao khả năng sống sót và phát huy vai trò probiotic của chủng vi sinh vật được vi gói trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường, điển hình là điều kiện pH thấp của dạ dày và muối mật của đường ruột [8].Vì vậy, việc khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn B. longum trong môi trường nhân tạo (SGJ) pH=2 và trong môi trường muối mật là cần thiết để đánh giá về hiệu quả của vi gói đối với sự sống sót của vi khuẩn
B. longum.
3.4.1. Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B. longum trong hạt vi g i tr n
môi trƣờng dạ dày nhân tạo (SGJ) pH=2
Kết quả x lý hạt vi gói vi khuẩn B. longum trong môi trường SGJ (370C) ở pH=2 với các khoảng thời gian khác nhau được trình bày ở đồ thị 3.6. Mật độ tế bào tự do và chế phẩm vi gói ban đầu là 100% thì sau 30 phút trong môi trường dạ dày nhân tạo, tế bào tự do giảm chỉ còn khoảng 78,59%. Trong khi đó, mật độ tế bào vi khuẩn B. longum trong chế phẩm vi gói sụt giảm không nhiều so với tế bào tự do, còn khoảng 87,23-98,29% so với mật độ tế bào ban đầu. Sau 60 phút khảo sát, tế bào tự do còn khoảng 47,46%, trong khi đó, mật độ tế bào trong chế phẩm vi gói còn khoảng từ 81,05-91,52%.Sau 90 phút trong môi trường dạ dày nhân tạo, tế bào
Hình 3.4. H nh chụp hạt vi gói B. longum a và mặt c t trong hạt vi g i chụp b ng k nh M b
B. longum
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
60
tự do còn khoảng 32,26%, mật độ tế bào trong chế phẩm vi gói còn khoảng từ 67,37-84,04% so với mật độ tế bào ban đầu. Số liệu chi tiết của kết quả khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B. longum trong hạt vi gói trên môi trường dạ dày nhân tạo pH=2 được trình bày trong bảng 3.7 và bảng 3.8 phần phụ lục.
Như vậy, qua kết quả khảo sát trong môi trường dạ dày nhân tạo cho thấy, nếu không được bảo vệ bằng vi gói thì tế bào vi khuẩn B. longum chỉ còn khoảng 32,26% sau 90 phút khảo sát, như vậy vi khuẩn B. longum sẽ không phát huy tối đa vai trò probiotic của mình khi đi vào hệ tiêu hóa. Tế bào vi khuẩn B. longum được bao bọc lớp áo vi gói làm gia tăng đáng kể khả năng tồn tại được trong môi trường dạ dày nhân tạo. Các chế phẩm vi gói với nồng độ vật liệu vi gói khác nhau thì khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn cũng khác nhau. Chế phẩm vi gói với hỗn hợp vật liệu vi gói là gelatin 10% - alginate 2% và gelatin 10% - alginate 3% làm tăng khả năng chịu đựng của vi khuẩn trong môi trường dạ dày nhân tạo so với chế phẩm vi gói chứa gelatin12% - alginate 2% và gelatin 12% - alginate 3% vì khi nồng độ hỗn hợp vi gói cao làm gia tăng độ nhớt của dung dịch, làm cho quá trình đồng hóa kéo dài, góp phần gây ảnh hưởng đến sức sống của vi sinh vât.
Đồ thị 3.6. % tế bào B. longum tồn tại trong môi trƣờng SGJ (pH=2) ở các khoảng thời gian khảo sát khác nhau so với mật độ ban đầu
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
61
3.4.2. Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B. longum trong môi trƣờng
muối mật 0,3%.
Ngoài khả năng chịu được pH thấp của dạ dày thì khả năng chịu muối mật cũng là một tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả của vi khuẩn probiotic. Theo Havenaar và cộng sự (1992) thì đây là điều kiện tiên quyết để probiotic có thể tồn tại, nhân lên, cũng như có hoạt động trao đổi chất trong ruột non của vật chủ [26]. Kết quả khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B. longum trong môi trường muối mật 0,3% được thể hiện ở đồ thị 3.7.
Kết quả khảo sát cho thấy vi gói làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn B. longum trong môi trường 0,3% muối mật. Sau 60 phút khảo sát trong môi trường chứa 0,3% muối mật, B. longum tự do chỉ còn tồn tại khoảng 79,76% so với mật độ ban đầu, khi được bảo vệ bằng vi gói, vi khuẩn B. longum tồn tại từ 80,62-91,01%. Sau 120 phút khảo sát, tế bào B. longum tự do còn khoảng 56,53%, trong khi tế bào
B. longum được bảo vệ trong hạt vi gói còn tồn tại khoảng 59,44-73,89%. Khả năng
bảo vệ vi khuẩn B. longum khác nhau tùy thuộc vào hỗn hợp vi gói. Hỗn hợp vật liệu gelatin 10% - alginate 2% và gelatin 10% - alginate 3% có hiệu quả bảo vệ tốt
Đồ thị 3.7. % tế bào B. longum tồn tại trong môi trƣờng chứa 0,3% muối mật ở các khoảng thời gian khảo sát khác nhau so với mật độ ban đầu
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
62
hơn hai hỗn hợp vật liệu còn lại. Số liệu chi tiết của kết quả khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn B. longum trong hạt vi gói trên môi trường 0,3% muối mật được trình bày trong bảng 3.9 và bảng 3.10 phần phụ lục.
Tóm lại, qua hai kết quả khảo sát s tồn tại của B. longum trong hạt vi gói ở môi trường dạ dày nhân tạo pH=2 và môi trường chứa 0,3% muối mật cho thấy vi gói là phương pháp tích c c giúp duy trì và nâng cao khả năng sống sót của tế bào vi khuẩn probiotic trong môi trường c c đoan, giúp chúng có thể tồn tại và phát huy vai trò tích c c trong hệ thống tiêu hóa của vật chủ. Trong đ hai hỗn hợp vật liệu gelatin10% - alginate 2% và gelatin 10% - alginate 3% cho hiệu quả bảo vệ tốt. Chúng tôi l a chọn hai hỗn hợp vật liệu này vào các thí nghiệm tiếp theo để tìm ra tỉ lệ vật liệu vi gói cho hiệu quả tốt nhất.
3.5. Khảo sát biến động của pH, acid lactic trong quá trình lên men
Chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện của quá trình lên men chanh dây như khảo sát hàm lượng đường bổ sung, khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian lên men, khảo sát tỉ lệ giống bổ sung để xác định các điều kiện tối ưu của quá trình lên men chanh dây. Sau đó, chúng tôi tiến hành so sánh sự biến động của pH, lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men của hai hình thức tiếp giống bằng tế bào tự do và bằng chế phẩm vi gói.
3.5.1. Khảo sát các điều kiện của quá trình lên men chanh dây
Dựa theo số liệu trên đường cong sinh trưởng của chủng B. longum, chúng tôi tiến hành cấy giống vào môi trường dịch ép chanh dây (bổ sung 15% đường, điều chỉnh pH=5,0), tăng sinh sau 18-24 giờ ở 370
C, thu sinh khối. Xác định nồng độ vi khuẩn trong bình giống trước khi lên men bằng cách đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường MRS agar. Nồng độ vi khuẩn B. longum dùng để tiến hành th nghiệm vào khoảng 5,23x109CFU/ml và mật độ giống được theo dõi ổn định trong suốt thời gian thực hiện.
CHƢƠNG 3. KẾ Ả N ẬN
63
3.5.1.1. Khảo sát hàm lƣợng đƣờng bổ sung
Thí nghiệm này nhằm xác định lượng đường cần thiết cần bổ sung vào dịch