2.3.1. Thiết kế nghiờn cứu thực nghiệm
2.3.1.1. Nghiờn cứu xỏc định độc tớnh cấp
*Mục đớch: xỏc định LD50 của thuốc “Thụng mạch sơ lạc hoàn” trờn chuột nhắt trắng bằng phương phỏp Litchfield – Wilcoxon.
*Cỏch tiến hành
- Trước khi tiến hành thớ nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đờm.
- 10 lụ chuột nhắt trắng, mỗi lụ 10 con, được uống thuốc với liều tăng dần từ 76g dược liệu/kg đến 229g dược liệu/kg, với lượng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,2ml/10g cõn nặng, uống ba lần/24 giờ, mỗi lần cỏch nhau hai giờ.
- Đường dựng: cho uống bằng cỏch bơm hỗn dịch vào thẳng dạ dày chuột. - Thời gian theo dừi: 72h.
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ:
- Theo dừi tỡnh trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lụ trong 72 giờ. Sau đú tiếp tục theo dừi tỡnh trạng chung của chuột đến hết ngày thứ bảy sau khi uống chế phẩm thử.
- Quan sỏt cỏc hoạt động ăn uống và cỏc biểu hiện khỏc của chuột, ghi giờ xuất hiện cỏc triệu chứng bất thường, tỷ lệ chuột chết trong mỗi lụ. Nếu lụ nào cú chuột bị chết, mổ chuột kiểm tra đại thể để đỏnh giỏ tỏc dụng gõy độc cấp đối với cơ quan chịu tỏc động chớnh của thuốc.
2.3.1.2. Nghiờn cứu độc tớnh bỏn trường diễn của chế phẩm TMSLH
*Mục đớch: thăm dũ độc tớnh ngắn ngày khi cho thỏ uống thuốc trong bốn tuần.
*Cỏch tiến hành
- Thỏ được chia thành ba lụ, mỗi lụ 10 con, được nhốt riờng mỗi chuồng một con.
+ Lụ chứng cho uống nước cất, 5ml/kg/ngày.
+ Lụ điều trị 1: uống thuốc TMSLH 13,61g/kg/ngày (tương đương với liều dựng cho người, tớnh theo hệ số 3).
+ Lụ điều trị 2: Uống thuốc TMSLH liều 40,82g/kg/ngày (gấp 3 lần liều ở lụ trị 1).
- Tất cả thỏ được uống nước cất và thuốc thử với thể tớch tương đương 5ml/kg/ngày, mỗi ngày một lần vào 8 giờ sỏng, liờn tục trong bốn tuần.
- Lấy mỏu lần đầu để xỏc định cỏc thụng số bỡnh thường của thỏ trước khi uống.
- Sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc: lấy mỏu thỏ để kiểm tra cỏc chỉ số sau thời gian uống thuốc.
- Sau khi ngừng thuốc hai tuần: lấy mỏu thỏ để kiểm tra cỏc chỉ số sau khi ngừng thuốc hai tuần.
- So sỏnh cỏc chỉ số sau hai tuần và bốn tuần uống thuốc và sau khi ngừng thuốc hai tuần với cỏc chỉ số trước khi uống thuốc.
- Kết thỳc thớ nghiệm: mổ 30% thỏ ở lụ chứng và 30% thỏ ở lụ dựng thuốc ở thời điểm sau uống thuốc bốn tuần và sau ngừng thuốc hai tuần, quan sỏt đại thể và vi thể cỏc cơ quan như: gan, thận...
*Cỏch theo dừi và đỏnh giỏ
- Tỡnh trạng chung và cõn nặng của thỏ.
- Đỏnh giỏ chức năng tạo mỏu thụng qua cỏc chỉ số: số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, cụng thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu. Cỏc chỉ số trờn được định lượng trờn mỏy xột nghiệm huyết học Vet abcTM Animal Blood Counter của hóng ABX - Diagnostic (Phỏp).
- Đỏnh giỏ chức năng gan thụng qua định lượng một số enzym và một số chất: AST, ALT; bilirubin toàn phần, protein toàn phần, cholesterol. Cỏc chỉ số trờn được định lượng trờn mỏy xột nghiệm húa sinh Screen master của hóng Hospitex Diagnostic (Italia).
- Đỏnh giỏ chức năng thận bằng định lượng creatinin huyết thanh, được định lượng trờn mỏy xột nghiệm húa sinh Screen master của hóng Hospitex
Diagnostic (Italia).
- Mụ bệnh học: kiểm tra ngẫu nhiờn cấu trỳc đại thể và vi thể của gan và thận của 30% số thỏ ở mỗi lụ.
Xột nghiệm huyết học và sinh húa mỏu được thực hiện tại Bộ mụn Dược lý, Đại học Y Hà Nội.
Xột nghiệm đại thể, vi thể gan, thận...được thực hiện tại Bộ mụn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Hà Nội.
2.3.1.3. Nghiờn cứu tỏc dụng trờn tim mạch của chế phẩm TMSLH * Nghiờn cứu tỏc dụng hạ huyết ỏp của chế phẩm TMSLH
- Chú được bộc lộ tĩnh mạch đựi và được gõy mờ bằng thiopental dung dịch 5% với liều 0,02g/kg.
- Bộc lộ động mạch đựi. Ghi huyết ỏp động mạch đựi qua huyết ỏp kế thủy ngõn. Hệ thống cột thủy ngõn được nối với thiết bị cảm ứng điện ADI đo huyết ỏp, điện tim, hụ hấp và nhiệt độ dựng riờng cho động vật.
- Kết quả được hiển thị trờn một mỏy tớnh mắc nối tiếp. Thuốc thử được đưa theo đường uống liều 6,80g/kg/ngày tương đương liều lõm sàng (đó được ngoại suy liều trờn chú theo hệ số 2).
- Theo dừi huyết ỏp: cỏc chỉ số huyết ỏp tõm thu (HAtt), huyết ỏp tõm trương (HAttr), huyết ỏp trung bỡnh (HAtb), tần số tim... khi chưa uống thuốc thử và sau khi uống thuốc thử 30 phỳt/lần, liờn tục trong sỏu giờ.
Nghiờn cứu ảnh hưởng của TMSLH trờn huyết ỏp chú thụng qua hệ Adrenergic và hệ Cholinergic:
Bước1: theo dừi HA bỡnh thường (Ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 2: tiờm Adrenalin lần 1 liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ Adrenergic hoặc tiờm Acetylcholin
lần 1 liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ Cholinergic (Ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 3: uống TMSLH liều 6,80g/kg/ngày tương đương liều lõm sàng (đó được ngoại suy liều trờn chú theo hệ số 2), theo dừi cỏc chỉ số HA tại 4 thời điểm sau uống thuốc thử 30 phỳt, 60 phỳt, 90 phỳt và 120 phỳt (Ghi HAtt, HAttr, HAtb).
Bước 4: kết thỳc bước 3, tiờm Adrenalin lần 2 liều 0,03 mg/kg đường tĩnh mạch với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ Adrenergic hoặc tiờm Acetylcholin lần 2 liều gấp 10 lần so với lần 1 (0,3 mg/kg đường tĩnh mạch) với đỏnh giỏ ảnh hưởng của thuốc thử qua hệ Cholinergic (Ghi HAtt, HAttr, HAtb).
* Nghiờn cứu tỏc dụng gión mạch của chế phẩm TMSLH
- Tai thỏ được cụ lập theo phương phỏp Kravkov.
- Cỏch pha dung dịch truyền: pha dung dịch TMSLH với liều 4,5ml; 9ml; 45ml; 90ml; 180ml /1000ml Ringer vừa đủ được dung dịch thuốc thử ở cỏc nồng độ 0,45%; 0,9%; 4,5%; 9%; 18% .
- Truyền dung dịch thuốc thử đó pha ở độ cao 100 cm vào động mạch giữa. - Theo dừi số giọt dung dịch chảy ra ở hai tĩnh mạch vành tai trong một phỳt lỳc trước và sau khi dựng thuốc thử và sự ảnh hưởng của thuốc thử đến tỏc dụng của adrenalin. Nếu số giọt chảy ra ở hai tĩnh mạch rỡa tai tăng chứng tỏ mạch gión hoặc ngược lại nếu số giọt giảm chứng tỏ mạch co.
2.3.2. Thiết kế nghiờn cứu lõm sàng
2.3.2.1. Thiết kế nghiờn cứu: theo phương phỏp thử nghiệm lõm sàng mự đơn, cú đối chứng placebo.
2.3.2.2.Cỏch chọn mẫu
*Cỡ mẫu nghiờn cứu
Cỡ mẫu tớnh theo cụng thức nghiờn cứu lõm sàng của Tổ chức Y tế Thế giới: {[Z1-α/2√[2P(1 - P)+Zα√P1(1 - P1)+P2(1 - P2)]}2
n1 = n2 =
(P1 - P2)2
Trong đú:
n1: Cỡ mẫu nhúm nghiờn cứu (NNC) n2: Cỡ mẫu nhúm đối chứng (NĐC - 1)
Z1-α/2: Hệ số tin cậy 95% (=1,96); Zα: Lực mẫu (=1,645)
P1: Tỷ lệ bệnh nhõn nhúm nghiờn cứu đạt tốt: ước lượng là 85% [47]. P2: Tỷ lệ bệnh nhõn nhúm chứng đạt tốt: ước lượng là 65% [15]. P1 + P2 P = 2 Thay vào cụng thức tớnh: 0,85 + 0,65 P = = 0,75 2 {[1,96√[2x0,75(1 – 0,75)+1,645√0,85(1 – 0,85)+0,65(1 – 0,65)]}2 n1 = n2 = = 34 (0,85 – 0,65)2
Kết quả tớnh toỏn cỡ mẫu nhúm n1 = n2 = 34 bệnh nhõn và lấy trũn số mỗi nhúm ớt nhất là 35 bệnh nhõn. Trờn thực tế chỳng tụi lựa chọn 45 bệnh nhõn cho mỗi nhúm. Tổng cộng cú 90 bệnh nhõn.
*Chiến lược chọn mẫu: bệnh nhõn phải đỏp ứng cỏc tiờu chuẩn khỏc về đối tượng nghiờn cứu như đó đề cập ở phần 2.2.2.
2.3.2.3. Quy trỡnh nghiờn cứu
*Cỏc bệnh nhõn đều được thăm khỏm lõm sàng, làm bệnh ỏn, làm cỏc xột nghiệm cận lõm sàng và điền đầy đủ cỏc mục của bệnh ỏn nghiờn cứu được xõy dựng theo mẫu thống nhất.
*Chia nhúm nghiờn cứu: 90 bệnh nhõn được chia làm hai nhúm.
- Nhúm đối chứng (ĐC): dựng thuốc placebo và chế độ tập luyện, xoa búp và vận động theo bài tập thống nhất được thầy thuốc hướng dẫn (Phụ lục 4).
- Nhúm nghiờn cứu (NC): dựng thuốc nghiờn cứu và chế độ tập luyện, xoa búp và vận động theo bài tập thống nhất được thầy thuốc hướng dẫn (Phụ lục 4).
*Quy trỡnh điều trị
- Nhúm ĐC: gồm 45 bệnh nhõn được điều trị thuốc placebo 10g x 6 viờn/ngày chia hai lần sỏng, chiều sau ăn 30 phỳt, với liệu trỡnh điều trị 30 ngày.
- Nhúm NC: gồm 45 bệnh nhõn dựng chế phẩm TMSLH uống 10g x 6 viờn/ngày chia hai lần sỏng, chiều sau ăn 30 phỳt, liờn tục trong 30 ngày.
- Tất cả cỏc bệnh nhõn trờn đều được hướng dẫn chế độ ăn uống, sinh hoạt như sau: ăn giảm muối, giảm ăn chất bộo toàn phần và chất bộo bóo hoà, ăn thịt trắng, cỏ nạc, ăn nhiều rau xanh, quả tươi, ăn thức ăn dễ tiờu. Khụng ăn phủ tạng động vật, úc, trứng gà vịt, tụm cua chứa nhiều cholesterol, khụng uống rượu bia, khụng hỳt thuốc lỏ, trỏnh căng thẳng.
- Cỏc bệnh nhõn nhồi mỏu nóo sau giai đoạn cấp ở Khoa YHCT, Khoa Nội I, Khoa Hồi sức cấp cứu – Bệnh viện Đa khoa Xanh Pụn đủ tiờu chuẩn theo YHHĐ và YHCT được tuyển chọn vào nghiờn cứu. Bệnh nhõn được theo dừi trong điều kiện nội trỳ và ngoại trỳ trong thời gian 30 ngày.
*Quy trỡnh theo dừi và đỏnh giỏ
- Theo dừi:
+ Cỏc chỉ số theo dừi:
• Cỏc chỉ số đặc điểm chung, bệnh lý, huyết ỏp.
• Cỏc chỉ số lõm sàng liờn quan đến di chứng liệt nửa người Thang điểm Rankin
Thang điểm Barthel Thang điểm Orgogozo • Cỏc chỉ số cận lõm sàng:
Xột nghiệm huyết học (cụng thức mỏu, thời gian đụng mỏu nội sinh, thời gian đụng mỏu ngoại sinh).
Xột nghiệm húa sinh mỏu (urờ, glucose, creatinin, cholesterol, triglycerid, cholesterol - HDL, cholesterol - LDL, AST, ALT)
Chụp cắt lớp vi tớnh sọ nóo tại Khoa Chẩn đoỏn hỡnh ảnh - Bệnh viện Đa khoa Xanh Pụn (Lỳc vào viện để chẩn đoỏn xỏc định) .
• Tỏc dụng khụng mong muốn của thuốc nghiờn cứu. + Kỹ thuật đỏnh giỏ cỏc chỉ số:
• Huyết ỏp [71]:
Theo dừi chỉ số huyết ỏp: HAtt, HAttr, HAtb. Huyết ỏp được đo hàng ngày vào buổi sỏng, BN phải được nghỉ ngơi trước đú ớt nhất 15 phỳt, đo bằng huyết ỏp kế đồng hồ của Nhật bản.
Huyết ỏp trung bỡnh =
3
tt ttr
ΗΑ − ΗΑ + HAttr
Tiờu chuẩn đỏnh giỏ huyết ỏp: Theo phõn loại JNC - VI
Phõn loại huyết ỏp Huyết ỏp tõm thu (mmHg) Huyết ỏp tõm trương (mmHg) Tối ưu < 120 < 80 Bỡnh thường 120 – 129 80 – 84 Bỡnh thường cao 130 – 139 85 – 89 Tăng HA Độ 1 140 – 159 90 – 99 Độ 2 160 – 179 100 – 109 Độ 3 ≥ 180 ≥ 110
• Thang điểm Rankin [16], [57], [59]
Thang điểm này được Rankin đề xuất từ năm 1957 nhằm lượng giỏ mức độ tổn thiệt (handicap) của bệnh nhõn sau cỏc trường hợp chấn thương, bệnh lý mạch mỏu, phẫu thuật, cỏc bệnh tật khỏc.
Nội dung và cỏch đỏnh giỏ như sau (Phụ lục 3a): Độ 1: Phục hồi hoàn toàn.
Độ 2: Di chứng nhẹ, tự sinh hoạt được.
Độ 3: Di chứng vừa, sinh hoạt cần người giỳp đỡ. Độ 4: Di chứng nặng, sinh hoạt cần phục vụ hoàn toàn. Độ 5: Di chứng rất nặng, cú nhiều biến chứng.
• Chỉ số Barthel [16], [57], [59]:
Chỉ số này được đề xướng sử dụng trong lõm sàng từ 1965, để nhận định bệnh nhõn dựa vào khả năng hoạt động độc lập của họ về cỏc chức năng hàng ngày như:
Khả năng độc lập hay phụ thuộc trong ăn uống, tự ăn được hay cần trợ giỳp, cú khả năng bưng được bỏt cơm, cầm đũa hay khụng cầm được.
Bệnh nhõn cú tự ngồi dậy, cú tự ngồi xe lăn, di chuyển từ xe lờn giường...
Vệ sinh cỏ nhõn tại chỗ hay tự vào được nhà tắm, cụng việc đỏnh răng rửa mặt hàng ngày.
Cú tự mặc quần ỏo hay phải trợ giỳp.
Đi lại được trong phũng hoặc khụng đi lại được hay chỉ đứng được tại chỗ...
Bảng chỉ số Barthel cú tổng số 10 tiờu chớ nhận định về chức năng sinh hoạt hàng ngày của bệnh nhõn với tổng số điểm là 100 (Phụ lục 3b)
Cỏch đỏnh giỏ: Dựa trờn kết quả cho điểm theo bảng chỉ số Barthel, bệnh nhõn được phõn làm 4 độ như sau [19]:
Độc lập hoàn toàn: 76 đến 100 điểm (Độ I). Phụ thuộc một phần: 51 đến 75 điểm (Độ II). Phụ thuộc phần lớn: 26 đến 50 điểm (Độ IIII). Phụ thuộc hoàn toàn: 0 đến 25 điểm (Độ IV). • Thang điểm Orgogozo [16], [57], [59]:
Là phương thức đỏnh giỏ trạng thỏi chức năng thần kinh của bệnh nhõn sau khi TBMN. Thang điểm này gồm 10 mục kiểm tra dựa trờn quan sỏt và thăm khỏm chức năng cơ bản về ý thức, giao tiếp và vận động tứ chi.
Bảng thang điểm Orgogozo cú tổng số 10 tiờu chớ nhận định về chức năng thần kinh, kiểm tra dựa trờn quan sỏt và thăm khỏm chức năng cơ bản về ý thức, giao tiếp và vận động tứ chi với tổng số điểm là 100 (Phụ lục 3c).
Cỏch đỏnh giỏ: Dựa trờn kết quả cho điểm theo bảng thang điểm Orgogozo, bệnh nhõn được phõn làm 4 độ như sau [22]:
Độ I (Tốt): 90 - 100 điểm Độ II (Khỏ): 70 - 89 điểm
Độ III (Trung bỡnh): 50 - 69 điểm Độ IV (Kộm): < 50 điểm.
2.3.2.4. Tiờu chuẩn đỏnh giỏ kết quả, so sỏnh trước và sau điều trị của từng BN
ngụn ngữ, đỏnh giỏ phục hồi theo thang điểm Rankin, đỏnh giỏ mức độ liệt và sự phục hồi qua chỉ số Barthel và thang điểm Orgogozo.
- Cỏc chỉ số huyết học, húa sinh của cỏc bệnh nhõn nghiờn cứu.
- Đỏnh giỏ kết quả điều trị theo YHCT: hai thể TPKL và TPTP, thể hàn và thể nhiệt biến đổi theo thang điểm Rankin, Barthel và Orgogozo.
- Tỏc dụng khụng mong muốn của thuốc trờn lõm sàng:
+ Cỏc chỉ tiờu theo dừi: đau đầu, chúng mặt, rối loạn tiờu hoỏ, buồn nụn, nổi mề đay, cỏc triệu chứng khụng mong muốn khỏc.
+ Cỏch theo dừi: thống kờ cỏc loại và thời gian xuất hiện của cỏc tỏc dụng khụng mong muốn.
- Thời điểm theo dừi:
• Lõm sàng: cỏc bệnh nhõn nghiờn cứu đều được theo dừi và đỏnh giỏ đầy đủ cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu tại ba thời điểm như sau: ngày bắt đầu tiến hành nghiờn cứu (D0), sau 15 ngày điều trị (D15), sau 30 ngày điều trị (D30).
• Cận lõm sàng: cỏc chỉ số cận lõm sàng được đo lường vào thời điểm D0,D30 của quỏ trỡnh điều trị.
- Đỏnh giỏ kết quả điều trị: + Cỏch đỏnh giỏ:
Đỏnh giỏ tiến triển độ liệt của bệnh nhõn trờn từng chỉ số Rankin, Barthel và Orgogozo (dựa vào sự dịch chuyển độ liệt) sau điều trị:
Loại A: chuyển được 2 độ liệt trở lờn Loại B: chuyển lờn 1 độ liệt
Loại C: khụng chuyển độ liệt hoặc nặng lờn.
Đỏnh giỏ tỏc dụng khụng mong muốn trờn lõm sàng của bài thuốc nghiờn cứu: đau đầu, chúng mặt, rối loạn tiờu hoỏ, buồn nụn.
+ Thời gian đỏnh giỏ: so sỏnh cỏc thời điểm theo dừi của từng nhúm và so sỏnh giữa hai nhúm dựa trờn tỷ lệ % và giỏ trị trung bỡnh (X ).
2.3.3. Phương phỏp phõn tớch số liệu
- Số liệu thu được trong nghiờn cứu được phõn tớch, xử lý theo phương phỏp xỏc suất thống kờ y sinh học. Cỏc số liệu được xử lý trờn mỏy vi tớnh phần mềm SPSS 17.0.
Sử dụng thuật toỏn: tớnh tỷ lệ phần trăm (%), tớnh số trung bỡnh (X ), tớnh độ lệch chuẩn (SD).
- Student - t test: so sỏnh sự khỏc nhau giữa hai giỏ trị trung bỡnh (TB). - Kiểm định χ2: so sỏnh sự khỏc nhau giữa cỏc tỷ lệ (%).
Với p > 0,05 sự khỏc biệt khụng cú ý nghĩa thống kờ. Với p < 0,05 sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ.
2.3.4. Phương phỏp khống chế sai số
Để hạn chế cỏc sai số trong quỏ trỡnh nghiờn cứu, chỳng tụi thực hiện một số quy định yờu cầu được tuõn thủ như sau:
- Bệnh nhõn nghiờn cứu trong điều kiện nội trỳ và ngoại trỳ, được hướng dẫn đầy đủ về yờu cầu của điều trị, được theo dừi và giỏm sỏt chặt chẽ