Thành phần phế liệu của tôm thẻ có hàm lượng protein cao đặc biệt là ở đầu tôm. Vì vậy, trong đề tài này chọn đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus
vannamei) là đối tượng nghiên cứu. Đầu vỏ tôm được lấy từ nguyên liệu tôm thẻ
chế biến tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17).
2.1.2. Enzyme Protease
Đề tài sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân protein trong quá trình sản xuất chitin – chitosan. Enzyme Alcalase 2.4 L FG thu được từ Bacillus
licheniformis. Đây là enzyme protease được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi
sinh vật.
Sử dụng enzyme Alcalase cho hiệu suất khử protein tương đối cao. Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của
các amino acid vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler-Nissen, 1986), đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các amino acid thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000). Hoạt tính 2,4 AU-A/g. Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷100C. Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8, nhiệt độ 50 ÷ 600C (122 ÷ 1400F), DH (%) tối đa 15 ÷ 25.
Để kiểm soát đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân thì nên dừng phản ứng enzyme gần với DH% xác định. Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách xử lý nhiệt ở 850C, thời gian 10 phút. Enzyme Alcalase bị bất hoạt tại pH = 4 hay thấp hơn trong khoảng 30 phút. Phản ứng có thể dừng tức thời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như: Acid hydrochloric, phosphoric, malic, lactic,
acetic tăng nhiệt độ tức thời khó đạt được dưới các điều kiện công nghiệp và nó có thể khó để kiểm soát DH% do sự thủy phân vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu NL phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. NL sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa
nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. NL được rửa sạch và xay nhuyễn (trong đó có 50% là vỏ tôm và 50% là đầu tôm), tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là (3 – 5 mm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch,cân cho vào túi polyme (mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt
độ -200C.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân
Hình 2.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phâm bằng enzyme Alcalase
Tối ưu các thông số
Bã đã tách protein Đánh giá Thủy phân Nguyên liệu (xay nhỏ 3 – 5 mm) Tách protein bằng Alcalase Thời gian Nồng độ E/S Nhiệt độ
2.2.3. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein đầu vỏ tôm bằng enzyme Alcalase vỏ tôm bằng enzyme Alcalase
2.2.3.1. Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase tới quá trình thủy phân:
Thủy phân PLT bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ enzyme so với PLT là: 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% quá trình thủy phân tiến hành ở nhiệt độ
550C, pH 8, tỷ lệ nước so với NL là 1/1 (v/w), mỗi mẫu 300 g. Sau 8 giờ dừng phản ứng thủy phân bằng cách nâng nhiệt lên 900
C trong 5 phút. Rửa mẫu, đem phơi khô, bảo quản nơi thoáng mát và xác định hàm lượng protein còn lại trong mẫu. 0,05% 0,1% pH = 8 0,2% Nhiệt độ: 550C 0,4% Thời gian : 8h 0,6% TL: nước/NL = 1/1 0,8%
Hình 2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân
2.2.3.2. Xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Xác định thời gian thủy phân thích hợp cho phản ứng, bằng cách cho
Alcalase vào PLT đã xay nhỏ, tỷ lệ E/S đã chọn được ở trên, tỷ lệ nước/NL là 1/1, nhiệt độ 550C, các mẫu đều chứa 300 gam PLT. Thủy phân ở các thời gian: 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Dừng phản ứng bằng cách nâng nhiệt lên 900C trong 5 phút, mẫu được rửa sạch, và xác định hàm lượng protein còn lại trong mẫu.
Thủy phân
Xác định hàm lượng protein còn lại
Chọn tỷ lệ enzyme thích hợp Phế liệu Tôm
2h 4h 6h Tỷ lệ E/S thích hợp 8h pH :8.5 10h Nhiệt độ: 550C 12h
Hình 2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein
2.2.3.3.Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Tiến hành các mẫu thủy phân (mỗi mẫu 300 gam PLT) với các thông số
cố định: tỷ lệ E/S và pH thích hợp. Thủy phân ở nhiệt độ khác nhau: 400
C, 450 C, 500C, 550 C, 600 C, 650 C và 700C. Dừng phản ứng ở thời gian thích hợp đã xác
định ở trên. Lấy mẫu phân tích để chọn nhiệt độ thích hợp. 400 C 450 C 500C 550 C 600C 650C 700C
Hình 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Chọn nhiệt độ thích hợp Thời gian thích hợp pH :8 Tỷ lệ E/S thích hợp Thủy phân Xác định hàm lượng protein còn lại Nhiệt độ Phế liệu tôm Phế liệu tôm Thời gian Thủy phân
Đánh giá cảm quan và phân
tích hàm lượng Protein
2.2.3. Quy trình sản xuất chitin – chitosan ứng dụng enzyme Alcalase
Hình 2.5. Quy trình sản xuất chitosan ứng dụng enzyme Alcalase
8h, 550C NaOH 4% Alcalase 0,2% Khử protein Vỏ tôm (xay nhỏ 3 – 5 mm) Bã vỏ tôm Rửa trung tính Khử khoáng (HCl 4%, 12h, T0 phòng) Rửa trung tính Deacetyl (NaOH 70%, 4h, 800C) Rửa trung tính Chitosan Đánh giá chất lượng Rửa trung tính
Mô tả quy trình
Nguyên liệu vỏ đầu tôm được xay nghiền và khử protein bằng enzyme
protease (Alcalase) trong môi trường có pH và tỷ lệ E/S, nhiệt độ và thời gian theo chế độ đã được nghiên cứu ở trên. Cùng với đó là thủy phân bằng NaOH 4% nhiệt độ và thời gian tương ứng. Ta tiến hành thuỷ phân rồi lọc tách riêng phần dịch và phần bã. Phần dịch có thể tận dụng thu protein và asthaxanthin dùng để
sản xuất thức ăn chăn nuôi. Phần bã được rửa sạch, sấy khô, khử kháng bằng HCl và deacetyl bằng NaOH thu được chitosan.
2.2.4. Các phương pháp kiểm tra chất lượng chitosan
Hiện nay, ở nước ta chưa có một hệ thống chỉ tiêu đánh gia chất lượng của chitosan. Các chỉ tiêu nêu ra dưới đây là những chỉ tiêu mà em thu thập từ
những tài liệu trong nước và ngoài nước nhằm góp phần xây dựng một hệ thống chỉ tiêu hoàn chỉnh cho sản phẩm chitosan.
Phương pháp cảm quan và màu sắc trạng thái
Xác định hàm lượng ẩm theo phương pháp sấy khô đến khối
lượng không đổi
Cách tiến hành: Sấy cốc đến trọng lượng không đổi ở nhiệt độ 105oC, cân
trên phân tích (sai số 10-3g).Cho vào cốc khoảng 3 – 5 g Chitosan, cân tất cả
trên cân phân tích có độ chính xác như trên. Sau đó cho vào tủ sấy ở nhiệt độ
105oC, sấy đến trọng lượng không đổi, thời gian 16h, sấy xong đem làm nguội
ở bình hút ẩm và cân trên cân phân tích.
Tính kết quả:
Trong đó:
X: Hàm lượng ẩm (%) G: Trọng lượng cốc (g)
G1: Trọng lượng cốc + Chitosan trước khi sấy (g) G2: Trọng lượng cốc + Chitosan sau khi sấy (g)
Xác định hàm lượng khoáng tổng số theo phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi
Cách tiến hành: Cốc sứ đã rửa sạch cho vào tủ nung tới 650oC đến
trọng lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân trên cân phân tích có
độ chính xác 10-3 g. Cho vào cốc sứ đã nung khoảng 2 g Chitosan, cân tất cả
trên cân phân tích có độ chính xác như trên. Cho cốc Chitosan hóa tro đen ở
bếp điện trong tủ Host, đến khi thành tro đen, cho vào nung ở nhiệt độ
6500C, nung đến tro trắng, thời gian khoảng 16h, để nguội trong bình hút ẩ m và cân đến trọng lượng không đổi. Tiếp tục nung lại rồi để nguội trong bình hút
ẩm và cân đến trọng lượng không đổi.
Tính kết quả: Trong đó: X: Hàm lượng tro (%) G: Trọng lượng cốc (g) G1: Trọng lượng cốc + Chitosan (g) G2: Trọng lượng cốc + tro (g) Xác định độ nhớt của Chitosan
Phương pháp: Pha chitosan nồng độ 1% trong acid acetic 1%, sau đó tiến hành đo độ nhớt của dung dịch ở nhiệt độ 250C bằng máy đo độ nhớt , sử dụng roto số 2. Kết quả đo được xác định bằng công thức sau:
= k.α
Trong đó:
: Độ nhớt của Chitosan (centipoise)
α: Kết quảđọc được trên cửa sổ của nhớt kế
Bảng 2.2. Thông số máy đo độ nhớt LVSPINDLE FACTOR Spindle number Speed 1 or 61 2 or 62 3 or 63 4 or 64 0.3 200 1000 4000 20000 0.6 100 500 2000 10000 1.5 40 200 800 4000 3 20 100 400 2000 6 10 50 200 1000 12 5 25 100 500 30 2 10 40 200 60 1 5 20 100
Xác định độ hòa tan (PGS. TS Trần Thị Luyến, 2004)
Nguyên lý: Chitosan được hòa tan trong acid acetic, còn các hợp chất
Khác không hòa tan.
Tiến hành: Cân chính xác m (g) Chitosan, rồi hòa tan trong acid actic
1% với nồng độ 1%, khuấy đều trong 30 phút để cho Chitosan tan hoàn toàn. Sau đó đem lọc qua giấy lọc, rồi rửa lại bằng nước cất, đem sấy khô đến khối lượng không đổi ta xác định được độ tan của Chitosan.
Tính kết quả: Công thức tính hàm lượng chất không tan
% 100 * ) ( m B A m X Trong đó
m: khối lượng của chitosan (g)
A: Khối lượng phễu lọc + giấy lọc + tạp chất sau khi sấy (g) B: Khối lượng phễu lọc + giấy lọc trước khi sấy (g)
Xác định hàm lượng protein: Xác định bằng phương pháp kjeldahl
Nguyên lý: Vô cơ hóa mẫu để chuyển nitơ trong mẫu v ề dạng (NH4)2SO4
bền vững. Sau đó sục kiềm đặc để đẩy nitơ ở dạng (NH4)2SO4 về dạng NH3 bằng H2SO4 tiêu chuẩn, lượng H2SO4 tiêu chuẩn dư được xác định là kiềm tiêu chuẩn với chỉ thị là metyl đỏ 0,1%.
Tiến hành: Cân 1 g chitosan cho vào bình kjeldahl lấy 10 ml H2SO4 đậm
đặc, thêm 5 g hỗn hợp xúc tác CuSO4/ K2SO4 vào tiến hành vô cơ hóa mẫu. Khi dung dịch không màu (xanh trong cũng được), hết khói thì quá trình vô cơ
hóa mẫu đã kết thúc. Lúc này trong bình là (NH4)2SO4.
Chú ý: Nếu dung dịch chưa trong mà đã cạn thì lấy ra để nguội và thêm vài ml H2SO4đậm đặc rồi tiếp tục vô cơ hóa cho đến khi không màu.
Sau khi vô cơ hóa xong để nguội và dùng nước cất pha loãng thành 250 ml ở bình định mức 250 ml. Lấy 10 ml dung dịch H2SO4 0,1N và 5 giọt metyl đỏ
0.1 % vào cốc hứng 250 ml đặt dưới đầu ống sinh hàn. Lấy 10 ml mẫu đã pha loãng cho vào bình chưng cất của thiết bị, cho vài giọt phenolphtalein 1% và cho từ từ dung dịch NaOH 35% đến khi chuyển thành màu đỏ. Tiến hành chưng cất khoảng 20 phút rồi thử bằng giấy đo pH khi pH =7 thì dừng. Dùng NaOH 0,1 N chuẩn độ dung dịch trong cốc hứng đến khi dung dịch chuyển từ màu đỏ
sang màu vàng thì dừng lại. Tính kết quả: m b a Nts( )0.0014100 Trong đó: a: Số ml H2SO4 0,1 N dùng trong cốc hứng b: Số ml NaOH 0,1 N dùng trong chuẩn độ
Phương pháp tính hiệu suất khử protein
Đầu tiên xác định hàm lượng protein có trong mẫu vỏ tôm ban đầu và hàm
lượng protein có trong bã sau khi thủy phân ta có sẽ tính kết quả theo công thức sau: (%) 100 1 2 1 X X X X Trong đó: X: Hiệu xuất khử protein
X1: Hàm lượng protein có trong mẫu NL ban đầu X2:Hàm lượng protein bã sau thủy phân
Xác định độ deacetyl
Cách tiến hành: cân 100mg chitosan sau đó cho thêm 20ml H3PO4 đậm đặc (85%). Tiến hành khuấy đảo ở nhiệt độ 60oC trong vòng 40 phút. Sau đó lấy
1ml dung dịch và thêm 19ml dung dịch nước cất và tiến hành ủ trong 24h. Tiến
hành đô trên thiết bị đo UV ở bước sóng 210nm. Đọc kết quả trên máy đo sau đó xác định độ deactyl bằng đường chuẩn N – acetylglucosamine.
Y = 1.0556X + 0.0221. R = 0.9999
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý theo phần mềm Excel 2003. Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 thí nghiệm , mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần, lấy kết quả trung bình cộng 3 lần thí nghiệm.
Phương pháp tối ưu hóa theo phần mềm Nemrodw, kết quả tối ưu xử lý trên phần mềm Excel 2003.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ
Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng
STT Thành phần Hàm lượng (%)
1 protein 44,5
2 Hàm lượng khoáng 26,8
3 Độẩm 78,9
Kết quả phân tích cho thấy ở phế liệu tôm thẻ chân trắng có hàm lượng protein thô cao (44,5% theo trọng lượng khô), hàm lượng khoáng tương đối cao.
Do đó, sau quá trình thủy phân protein bằng enzyme ở phế liệu này ta có thể vừa tận dụng lượng dịch thủy phân làm thức ăn cho gia xúc… đồng thời nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan vừa có hiệu quả kinh tế, vừa mang ý nghĩa môi trường.
3.2. Ảnh hưởng của quá trình thủy phân đến hiệu quả khử protein và khử
khoáng
3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/nguyên liệu đầu vỏ tôm (v/w)
đến hiệu khử protein
Tiến hành 7 mẫu thủy phân PLT bằng Alcalase với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau: 0; 0,05%; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8% (v/w) so với nguyên liệu.
Trong đó mẫu 1: không bổ sung enzyme, mẫu 2: bổ sung 0,05%, mẫu 3: bổ sung 0,1%, mẫu 4: bổ sung 0,2%, mẫu 5: bổ sung 0,4%, mẫu 6: bổ sung 0,6%, mẫu 7: bổ sung 0,8%. Tất cả các mẫu thủy phân đều tiến hành ở nhiệt độ 550C, pH 8 với tỷ lệ nước/NL là 1:1 (v/w), mỗi mẫu thủy phân đều chứa 300 g PLT. Sau 8 giờ
70 75 80 85 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 E/S H ( % )
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ E/S đến % protein khử được sau quá trình thủy phân
Quá trình thủy phân để khử protein của phế liệu tôm bằng enzyme phụ
thuộc vào nhiều yếu tố như: tỷ lệ E/S, pH, nhiệt độ, thời gian…Trong đó tỷ lệ
E/S là một yếu tố quan trọng và ảnh hưởng nhiều đến tốc độ thủy phân.. Khi nồng độ enzyme càng tăng thì phản ứng thuỷ phân cắt đứt liên kết trong phân tử
protein xảy ra càng mạnh. Các phân tử protein bị thuỷ phân thành các thành phần
như polypeptid, peptid, acid amin… hoà tan vào dung dịch. Tăng tốc độ thủy phân còn phụ thuộc vào việc tăng sự tiếp xúc enzyme và cơ chất bằng việc xay nhỏ nguyên liệu, do đó giảm được thời gian thủy phân.
Từ kết quả thí nghiệm cho thấy khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung vào phế liệu tôm trong khoảng từ 0,05% - 0,8% thì hàm lượng protein giảm tỷ lệ thuận với
lượng enzyme bổ sung vào NL. Tỷ lệ enzyme so với NL tối ưu ở 0,2% (v/w). Sau 8 giờ thủy phân bằng enzyme Alcalase tại nồng độ 0,2% hàm lượng protein khử được là 81,8 %... Khi tăng tỷ lệ E/S thì % protein khử được cao hơn so với mẫu 1. Ở mẫu 2, 3 hiệu suất thủy phân chưa cao do hầu như chỉ có enzyme trong đầu tôm hoạt động, mặt khác phản ứng thủy phân có sự xúc tác của enzyme phụ
thuộc rất nhiều vào tỷ lệ E/S, mẫu 2, 3 có bổ sung enzyme nhưng lượng cơ chất nhiều nên sự chuyển hóa enzyme chậm làm cho hiệu suất thủy phân thấp đạt 75,6% và 78,4%. Ở tỷ lệ E/S lớn hơn 0,2% (v/w) hàm lượng protein giảm tương đối lớn do trong điều kiện thừa cơ chất ta tăng nồng độ enzyme thì quá trình thủy
phân xảy ra càng mãnh liệt. Tuy nhiên, sự gia tăng quá trình khử protein ở đây