Nhận xét
Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, hàm lượng protein và khoáng thấp, độ Deacetyl tương đối cao.
Nguyên liệu Ngâm NaOH 4% (24h, 300C) Rửa trung tính Ngâm trong HCl 4% (18h, 300C) Rửa trung tính Sấy khô Chitin Deacetyl hóa (Nấu trong NaOH 50%, 650C, 20h) Rửa trung tính Sấy khô Chitosan
1.6. Giới thiệu về enzyme protease và quá trình thủy phân 1.6.1. Enzyme protease
Protease là enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptid (CO – NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
Hiệu suất xúc tác của nó có thể gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần so với các chất xúc tác vô cơ khác. Quan trọng hơn nữa là nó có khả năng xúc
tác cho phản ứng hóa học xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, nhiệt độ và áp suất bình thường, pH môi trường gần như pH sinh lý và có khả năng xúc tác đặc hiệu
cao đối với kiểu phản ứng cũng như cơ chất mà nó tác dụng, sản phẩm tạo ra thuần khiết, ít tạp chất.
Do những ưu điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme
trong đời sống mang nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn.
1.6.2. Protein thủy phân
Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên kết peptid. Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein. Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được tách ra do sự
tấn công neucleophilic bởi phân tử nước, tạo thành acid carboxylic và amin. Nhóm carboxylvà nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều
hơn hay ít ion hóa hơn, phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân. Từ đây sẽ
hình thành anion R-COO-
và cation R-NH3.
Theo Alder – Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH2) có thể cũng
hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptid. Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion R-COO- và cation R-NH3+. Vì vậy, trong quá trình thủy phân protein, các nhóm amino tự do hình thành cũng hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein. Sự thủy phân protein diễn ra rất chậm ở điều kiện bình thường, ví dụ pH trung tính và nhiệt độ phòng. Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn, ví
protease hay proteinase. Thông thường, enzyme tác dụng và chuyển hoá cơ chất trải qua ba giai đoạn sau:
Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện và liên kết Hydrogen.
Giai đoạn II: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hoá xảy ra sự biến đổi cơ
chất, dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme
làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết
trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
Giai đoạn III: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và giải phóng
enzyme. Đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do như ban đầu. Dưới đây
là minh họa cơ chế xúc tác của protease trong phản ứng thủy phân protein:
Trong đó:
E: Enzyme S: Cơ chất P: Sản phẩm
ES: Phức chất enzmyme – cơ chất
ES*: Phức chất enzyme – cơ chất dạng hoạt động (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phân và cấu trúc của các peptid tạo thành. Điều này phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng, cũng như việc kiểm soát các thông số của quá trình thủy phân như nhiệt đô, pH... nó sẽ làm giảm các phụ
phẩm của quá trình thủy phân và cải thiện các tính chất và chức năng như: Khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, độ nhớt, sự tạo gel và khả năng hấp thụ nước... Giá trị dinh dưỡng của protein thường được giữ nguyên hay tăng lên bởi enzyme thủy phân, khi mà tiến hành dưới các điều kiện phản ứng nhẹ nhàng. Protein bị
cắt mạch thành các đơn vị nhỏ hơn như peptid hay acid amin.
Cách tác động: Endoprotease tiến hành tách các liên kết peptid ở bên trong của nhánh polypeptid, trong khi exopeptidase tách rời các amino acid ở vị trí đầu tiên và cuối cùng của nhánh polypeptid.
Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc độ
thủy phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian. Phản ứng thủy phân tạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme. Độ thủy phân tối
đa có thể đạt được phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và đặc trưng của enzyme.
1.6.3. Các yếu tốảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Trong quá trình thủy phân vỏ đầu tôm bằng protease có nhiều yếu tốảnh
hưởng tới tốc độ thủy phân như:
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng
hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể
hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định. Thông thường đối với
đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷ 500C và nhiệt độ lớn
hơn 700
C đa số enzyme bị mất hoạt tính. Do vậy nhiệt độ 700
C gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme. Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độ tăng 100
C thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng từ 1,5 – 2 lần. Nhiệt độ
thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ
chất.
Ảnh hưởng của pH: Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH. Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu, chỉ
rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng axit hay kiềm. Phế liệu tôm có thể bị
thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn
enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo
môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hưởng của các enzyme khác.
Ảnh hưởng của thời gian: Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn
đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm. Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất. Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức
sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scaptol… đồng thời khi kéo dài hiệu quả kinh tế kém. Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu và gây khó khăn cho khâu lọc rửa
để thu dịch protein, cho công đoạn khử khoáng và khử màu.
Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease và phế liệu tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân. Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm. Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu
càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt. Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme
bao nhiêu đi nữa vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi enzyme protease kết hợp với
cơ chất là phế liệu tôm, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất. Phức chất này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme. Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn
ra đều đặn, nhanh chóng.
Độ tươi của nguyên liệu: Độ tươi của phế liệu tôm có vai trò quan trọng quyết định đến chất lượng của sản phẩm protein thu hồi từ quá trình thủy
phân và chitin. Độ tươi của phế liệu tôm giảm thì làm giảm chất lượng của bột protein do có sự phân hủy protein trong đầu tôm tạo thành những sản phẩm cấp thấp như: indol, scaptol, H2S, NH3… gây ra mùi khó chịu cho sản phẩm.
Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân:Nước là
môi trường thuận lợi cho hoạt động của enzyme và vi sinh vật. Do vậy quá trình thủy phân nguyên liệu vỏ đầu tôm nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế được hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân. Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp. Vì vậy, xác định các tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân.
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm
Thành phần phế liệu của tôm thẻ có hàm lượng protein cao đặc biệt là ở đầu tôm. Vì vậy, trong đề tài này chọn đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus
vannamei) là đối tượng nghiên cứu. Đầu vỏ tôm được lấy từ nguyên liệu tôm thẻ
chế biến tại Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17).
2.1.2. Enzyme Protease
Đề tài sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân protein trong quá trình sản xuất chitin – chitosan. Enzyme Alcalase 2.4 L FG thu được từ Bacillus
licheniformis. Đây là enzyme protease được phân tách và tinh sạch từ nguồn vi
sinh vật.
Sử dụng enzyme Alcalase cho hiệu suất khử protein tương đối cao. Chọn enzyme này cũng dựa trên đặc trưng của nó cho khả năng không hút nước của
các amino acid vào giai đoạn cuối, dẫn đến sản phẩm thủy phân không có vị đắng (Adler-Nissen, 1986), đồng thời sản phẩm có sự cân bằng tốt các amino acid thiết yếu (Kristinsson và Rasco, 2000). Hoạt tính 2,4 AU-A/g. Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0÷100C. Điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme Alcalase AF 2.4 L: pH = 8, nhiệt độ 50 ÷ 600C (122 ÷ 1400F), DH (%) tối đa 15 ÷ 25.
Để kiểm soát đặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân thì nên dừng phản ứng enzyme gần với DH% xác định. Tất cả protease có thể bị bất hoạt bằng cách xử lý nhiệt ở 850C, thời gian 10 phút. Enzyme Alcalase bị bất hoạt tại pH = 4 hay thấp hơn trong khoảng 30 phút. Phản ứng có thể dừng tức thời bằng cách thêm vào các acid thích hợp như: Acid hydrochloric, phosphoric, malic, lactic,
acetic tăng nhiệt độ tức thời khó đạt được dưới các điều kiện công nghiệp và nó có thể khó để kiểm soát DH% do sự thủy phân vẫn tiếp tục trong suốt giai đoạn bất hoạt.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu NL phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. NL sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa
nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. NL được rửa sạch và xay nhuyễn (trong đó có 50% là vỏ tôm và 50% là đầu tôm), tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là (3 – 5 mm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch,cân cho vào túi polyme (mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt
độ -200C.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phâm bằng enzyme Alcalase
Tối ưu các thông số
Bã đã tách protein Đánh giá Thủy phân Nguyên liệu (xay nhỏ 3 – 5 mm) Tách protein bằng Alcalase Thời gian Nồng độ E/S Nhiệt độ
2.2.3. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein đầu vỏ tôm bằng enzyme Alcalase vỏ tôm bằng enzyme Alcalase
2.2.3.1. Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase tới quá trình thủy phân:
Thủy phân PLT bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ enzyme so với PLT là: 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8% quá trình thủy phân tiến hành ở nhiệt độ
550C, pH 8, tỷ lệ nước so với NL là 1/1 (v/w), mỗi mẫu 300 g. Sau 8 giờ dừng phản ứng thủy phân bằng cách nâng nhiệt lên 900
C trong 5 phút. Rửa mẫu, đem phơi khô, bảo quản nơi thoáng mát và xác định hàm lượng protein còn lại trong mẫu. 0,05% 0,1% pH = 8 0,2% Nhiệt độ: 550C 0,4% Thời gian : 8h 0,6% TL: nước/NL = 1/1 0,8%
Hình 2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân
2.2.3.2. Xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Xác định thời gian thủy phân thích hợp cho phản ứng, bằng cách cho
Alcalase vào PLT đã xay nhỏ, tỷ lệ E/S đã chọn được ở trên, tỷ lệ nước/NL là 1/1, nhiệt độ 550C, các mẫu đều chứa 300 gam PLT. Thủy phân ở các thời gian: 2h, 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Dừng phản ứng bằng cách nâng nhiệt lên 900C trong 5 phút, mẫu được rửa sạch, và xác định hàm lượng protein còn lại trong mẫu.
Thủy phân
Xác định hàm lượng protein còn lại
Chọn tỷ lệ enzyme thích hợp Phế liệu Tôm
2h 4h 6h Tỷ lệ E/S thích hợp 8h pH :8.5 10h Nhiệt độ: 550C 12h
Hình 2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein
2.2.3.3.Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Tiến hành các mẫu thủy phân (mỗi mẫu 300 gam PLT) với các thông số
cố định: tỷ lệ E/S và pH thích hợp. Thủy phân ở nhiệt độ khác nhau: 400
C, 450 C, 500C, 550 C, 600 C, 650 C và 700C. Dừng phản ứng ở thời gian thích hợp đã xác
định ở trên. Lấy mẫu phân tích để chọn nhiệt độ thích hợp. 400 C 450 C 500C 550 C 600C 650C 700C
Hình 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Chọn nhiệt độ thích hợp Thời gian thích hợp pH :8 Tỷ lệ E/S thích hợp Thủy phân Xác định hàm lượng protein còn lại Nhiệt độ Phế liệu tôm Phế liệu tôm Thời gian Thủy phân
Đánh giá cảm quan và phân
tích hàm lượng Protein
2.2.3. Quy trình sản xuất chitin – chitosan ứng dụng enzyme Alcalase
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.5. Quy trình sản xuất chitosan ứng dụng enzyme Alcalase
8h, 550C NaOH 4% Alcalase 0,2% Khử protein Vỏ tôm (xay nhỏ 3 – 5 mm) Bã vỏ tôm Rửa trung tính Khử khoáng (HCl 4%, 12h, T0 phòng) Rửa trung tính Deacetyl (NaOH 70%, 4h, 800C) Rửa trung tính Chitosan Đánh giá chất lượng Rửa trung tính
Mô tả quy trình
Nguyên liệu vỏ đầu tôm được xay nghiền và khử protein bằng enzyme
protease (Alcalase) trong môi trường có pH và tỷ lệ E/S, nhiệt độ và thời gian theo chế độ đã được nghiên cứu ở trên. Cùng với đó là thủy phân bằng NaOH 4% nhiệt độ và thời gian tương ứng. Ta tiến hành thuỷ phân rồi lọc tách riêng phần dịch và phần bã. Phần dịch có thể tận dụng thu protein và asthaxanthin dùng để
sản xuất thức ăn chăn nuôi. Phần bã được rửa sạch, sấy khô, khử kháng bằng HCl