1.5.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin – chitosan trên thế giới
Từ những năm 30 của thế kỷ này việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc và tính chất hóa lý và ứng dụng của chitin – chitosan đã được công bố, cho đến nay chitin – chitosan được đưa vào ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong
đó lĩnh vực sinh học và đạt hiệu quả cao.
Năm 1971, Allan và cộng sự đã dụng chitosan để kết tủa Agaropectin trong agar – agar và chiết Agarose. Somchai đã báo cáo kết quả dùng chitosan để
làm giảm phần tử tích điện âm trong Agaropectin và có thể nhận được agar tinh khiết hoặc Agarose.
Năm 1972, hãng Kyowa Oid ansd Fat của Nhật lần đầu tiên được đưa vào
sản xuất công nghiệp chitin.
Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua, đã cho thấy việc thu hồi các chất này rất có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần chitin thu được dùng để sản xuất ra các dẫn xuất khác.
Năm 1990, sản lượng chitosan trên thế giới vào khoảng 1200 tấn. Hiện nay, đi đầu trong lĩnh vực sản xuất và ứng dụng chitin – chitosan là Nhật đã sản suất 600 tấn trên năm, Mỹ 400 tấn/năm. Ngoài ra còn có các nước như Trung
Quốc, Ấn Độ, Pháp cũng sản xuất và ứng dụng chitin – chitosan.
Nghiên cứu công nghệ sản suất chitin – chitosan phải gắn liền với đặc tính sinh học, hóa học, tính chất lý hóa và ứng dụng trong các lĩnh vực mới có thể giải quyết liên hoàn từ khâu sản xuất đến khâu tiêu thụ nhằm đem lại hiệu quả kinh tế
kỹ thuật. Nhiều nước như Nhật, Mỹ, Anh, Hội chitin thuộc cộng đồng Châu Âu
(ECCHIS)…đã và đang nghiên cứu một cách có hệ thống và đề cập nhiều nội dung khoa học trong đó có việc ứng dụng chitosan như một chất hấp thụ trao đổi
Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị về các chế phẩm chitin – chitosan sử dụng là 335 triệu USD trong đó có 190 triệu USD thuộc ngành y tế, sau đó là nông
nghiệp và mỹ phẩm, một vài công ty ở Mỹ đã nghiên cứu chiết rút chitin – chitoasan từ sự lên men nấm.
Hiện nay có khoảng 10 công ty lớn hầu hết ở Nhật, sản xuất chitin – chitosan ở trên thế giới, công ty Protan, BioPolymer, một trong những công ty sản xuất chitin – chitosan đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc chitosan sử dụng thích hợp để xử lý nước, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và nhiều ứng dụng các trong nông nghiệp.
Ngày nay người ta tập trung vào các dẫn xuất của chitin và khả năng ứng dụng của các dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của
A.AMuzzarelli (Đại học Y Khoa Ancona - Ý) tập trung vào chitin và đãn xuất của nó. Ông đã quan tâm nhiều đến dẫn xuất N-cacboxymetyl chitosan, N- cacboxybutyl chitosan và 5-metyl-pyrolidinon chitosan. Những chất này dễ hòa
tan trong nước tạo màng cho nên nó được ứng dụng phổ biến.
Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin – chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ.
Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường.
1.5.2. Một số quy trình sản xuất chitin – chitosan trên thế giới
Những nhận xét về ưu – nhược điểm của các quy trình sản xuất chitosan
dưới đây là nhận xétcủa PGS, TS Trần Thị Luyến-Trường Đại họcNha Trang.
1.5.2.1. Quy trình thủy nhiệt Yamasaky và Nacamichi Nhật Bản (1996)
Nhận xét
Sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp do nhiệt độ xử lý ở các công
đoạn cao. Vỏ cua khô Khử chất vô cơ (HCl 2M, 120oC, 1h) Rửa trung tính Sấy khô Sấy khô Chitosan Rửa trung tính Khử protein và deacetyl (NaOH 15M, 150oC, 1h)
1.5.2.2. Quy trình sản xuất chitosan của pháp (1996)
Ưu điểm
Thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố. Ngâm acetone Ngâm NaOCl (0.135%, 6h, to phòng) Rửa trung tính Deacetyl NaOH 40%, 4h, 850C) Rửa trung tính Chitosan Vỏ tôm Hấp chín, phơi khô Rửa trung tính Khử khoáng (HCl 2M, 2h, to phòng) Tách Protein (NaOH 3,5%, 65oC, 2h) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhược điểm
Do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch Polymer do đó độ nhớt của sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác Aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều và giá thành sản phẩm cao. Chưa kể đến các yếu tố an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện của nước ta hiện nay.
1.5.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin – chitosan ở Việt Nam
Việc nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất, phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta. Năm
1978, Đỗ Minh Phụng - trường Đại học Thủy Sản bắt đầu nghiên cứu chiết tách chitin – chitosan.
Trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin khoa học, kỹ thuật mới về chitin – chitosan, cũng như tiềm năng
thị trường của chúng, đã thúc đẩy các nhà khoa học nước ta bắt tay nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng ở các lĩnh vực khác nhau.
Gần đây, chitin – chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Đại học Tổng hợp Tp. Hồ Chí Minh… đã tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng công nghệ này. Tuy nhiên, chất lượng sản xuất và ứng dụng của nó chưa được đánh giá đầy đủ.
Ở phía bắc, viện khoa học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp Thủy đặc sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và thu được hiệu quả bước đầu.
Ở phía nam, Trung tâm Công nghệ và Sinh học Thủy sản kết hợp với một số cơ quan khác: Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh, Phân Viện Khoa học Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam đã và đang nghiên cứ sản xuất ứng dụng chitosan trong các lĩnh vực: Nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm.
Năm 1998 – 2000 Trường Đại học Thủy Sản (nay là Đại học Nha Trang)
đã sản xuất thành công chitin – chitosan từ vỏ tôm sú, tôm Mũ nì, vỏ tôm hùm, vỏ ghẹ. Một dự án sản xuất thử nghiệm chitin – chitosan đã hoàn thành năm 2003. Trường Đại học Nha Trang đã chuyển giao công nghệ sản xuất chitin –
chitosan cho một số cơ sở sản xuất. Hiện nay một số sản phẩm chitin – chitosan của Trung tâm Chế biến Thủy sản của Trường Đại học Nha Trang đang có uy tín
cao, sản phẩm bắt đầu ứng dụng mạnh mẽ vào một số cơ sở sản xuất và nghiên cứu ở nước ra và đang chào hàng đi Thái Lan. Sản phẩm chitosan của Trường
Đại học Nha Trang đã góp phần giúp giảm nhập khẩu chế phẩm này ở nước ta.
1.5.4. Một số quy trình sản xuất chitin – chitosan ở Việt Nam
1.5.4.1. Quy trình của GVC Đỗ Minh Phụng – Đại học Thủy sản (1980)
Vỏ tôm khô Ngâm HCl ( HCl 6N, 48h, T0 phòng ) Rửa trung tính Ngâm NaOH NaOH 8%, 2h, 0 Rửa trung tính Tẩy màu Ngâm NaOH (NaOH 40%, 24h, 800C) Chitin Rửa trung tính Chitosan
Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp.
Nhược điểm: Sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó dễ ảnh hưởng đến độ
nhớt của sản phẩm, hơn nữa thời gian xử lý quá dài.
1.5.4.2. Quy trình sản xuất chitin – chitosan ở Trung tâm cao phân tử thuộc Viện Khoa học Việt Nam (1996) Viện Khoa học Việt Nam (1996)
Ngâm NaOH
( NaOH 3,5%, 3h, 90 – 95 o C)
Nấu trong NaOH đặc
Chitosan Rửa trung tính Ngâm HCl ( HCl 4%, 24h, to phòng) Nguyên liệu Rửa trung tính Ngâm NaOH ( NaOH 3,5%, 3h, 90 – 95 oC) Ngâm HCl ( HCl 4%, 24h, to phòng) Rửa trung tính
Nhận xét
Sản phẩm chitosan theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của GVC Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn.
1.5.4.3. Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy đặc sản Hà Nội
Nguyên liệu Rửa trung tính Tách khoáng lần 1 (HCl 4%, 24h, t0 phòng) Tách khoáng lần 2 (HCl 4%, 24h, t0 phòng) Rửa trung tính Tách Protein lần 1 (NaOH 2%, 3h, 90 – 950C) Tách Protein lần 2 (NaOH 2%, 3h, 90 – 950C) Rửa trung tính Sấy khô Chitin Rửa trung tính Tách khoáng lần 3 (HCl 4%, 24h, t0 phòng) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ưu điểm:Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu.
Nhược điểm: Thời gian sản xuất dài, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch
polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm.
1.5.4.4. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm PGS, TS Trần Thị Luyến – Đại học Thủy sản với một công đoạn xử lý kiềm PGS, TS Trần Thị Luyến – Đại học Thủy sản
Vỏ tôm khô Vỏ tôm tươi
Ngâm HCl Ngâm HCl (HCl 10%, 5h, T0 phòng w/v = 1/5) (HCl 10%, 5h, T0 phòng w/v = 1/10) Rửa sạch NaOH 40%, 5h, 80 ±20C Rửa sạch Chitosan
Bảng 1.2. Chất lượng chitin – chitosan thu được theo phương pháp xử lý kiềm một công đoạn Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quả Màu sắc Trắng đẹp Độ deacetyl 76,25% Trạng thái Mềm mại Thời gian thực hiện 9,5h Độẩm 10% Nts 8,07% Hàm lượng tro 0,023% Hiệu suất 40,25%
Hàm lượng các chất không tan 1,60% Độ tan 98,32%
Độ nhớt 14,380E Phản ứng Biure Âm tính
1.5.4.5. Quy trình sử dụng enzyme papain để sản xuất chitosan PGS, TS Trần Thị Luyến – ĐHNT Chitosan Deacetyl (NaOH 35%, 6h, 800C) Rửa sạch Rửa sạch Vỏ tôm tươi Ngâm HCl (HCl 10%, 5h, t0 phòng w/v = 1/10) Vỏ tôm khô Ngâm HCl (HCl 10%, 5h, t0 phòng w/v = 1/5) Rửa sạch Khử protein (Papain 13%, 4h, 70 - 800C, pH = 5) Rửa sạch Chitin
Bảng 1.3. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitin – chitosan sản xuất theo quy trình Papain
Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quả
Màu sắc Trắng trong Độ deacetyl 78,27% Trạng thái Mềm mại Độ nhớt 15,250E Độẩm 10,10% Nts 8,25% Hàm lượng tro 0,68% Hiệu suất 41,25% Hàm lượng các chất không tan 0,92% Độ tan 98,37% Nhận xét
Quy trình Papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác.
Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất quy trình có ưu thế hơn hẳn. Nhưng để
nâng cao chất lượng chitosan có thể sử sụng enzyme papain thay thế cho NaOH
để khử protein trong vỏ tôm. Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng. Điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên cần nghiên cứu quá trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này. Cần tiếp tục sản xuất và chiết rút enzyme deacetylase để thay thế hoàn tất cho NaOH đặc
1.5.4.6. Quy trình sản xuất chitin – chitosan của TS. Trang Sỹ Trung - Đại Học Nha Trang Học Nha Trang
Nhận xét
Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, hàm lượng protein và khoáng thấp, độ Deacetyl tương đối cao.
Nguyên liệu Ngâm NaOH 4% (24h, 300C) Rửa trung tính Ngâm trong HCl 4% (18h, 300C) Rửa trung tính Sấy khô Chitin Deacetyl hóa (Nấu trong NaOH 50%, 650C, 20h) Rửa trung tính Sấy khô Chitosan
1.6. Giới thiệu về enzyme protease và quá trình thủy phân 1.6.1. Enzyme protease
Protease là enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptid (CO – NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
Hiệu suất xúc tác của nó có thể gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần so với các chất xúc tác vô cơ khác. Quan trọng hơn nữa là nó có khả năng xúc
tác cho phản ứng hóa học xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, nhiệt độ và áp suất bình thường, pH môi trường gần như pH sinh lý và có khả năng xúc tác đặc hiệu
cao đối với kiểu phản ứng cũng như cơ chất mà nó tác dụng, sản phẩm tạo ra thuần khiết, ít tạp chất.
Do những ưu điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme
trong đời sống mang nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn.
1.6.2. Protein thủy phân (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên kết peptid. Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein. Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được tách ra do sự
tấn công neucleophilic bởi phân tử nước, tạo thành acid carboxylic và amin. Nhóm carboxylvà nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều
hơn hay ít ion hóa hơn, phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân. Từ đây sẽ
hình thành anion R-COO-
và cation R-NH3.
Theo Alder – Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH2) có thể cũng
hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptid. Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion R-COO- và cation R-NH3+. Vì vậy, trong quá trình thủy phân protein, các nhóm amino tự do hình thành cũng hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein. Sự thủy phân protein diễn ra rất chậm ở điều kiện bình thường, ví dụ pH trung tính và nhiệt độ phòng. Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn, ví
protease hay proteinase. Thông thường, enzyme tác dụng và chuyển hoá cơ chất trải qua ba giai đoạn sau:
Giai đoạn I: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện và liên kết Hydrogen.
Giai đoạn II: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hoá xảy ra sự biến đổi cơ
chất, dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme
làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết
trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
Giai đoạn III: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và giải phóng
enzyme. Đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do như ban đầu. Dưới đây
là minh họa cơ chế xúc tác của protease trong phản ứng thủy phân protein:
Trong đó:
E: Enzyme S: Cơ chất P: Sản phẩm
ES: Phức chất enzmyme – cơ chất
ES*: Phức chất enzyme – cơ chất dạng hoạt động
Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phân và cấu trúc của các peptid tạo thành. Điều này phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng, cũng như việc kiểm soát các thông số của quá trình thủy phân như nhiệt đô, pH... nó sẽ làm giảm các phụ
phẩm của quá trình thủy phân và cải thiện các tính chất và chức năng như: Khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, độ nhớt, sự tạo gel và khả năng hấp thụ nước... Giá trị dinh dưỡng của protein thường được giữ nguyên hay tăng lên bởi enzyme thủy phân, khi mà tiến hành dưới các điều kiện phản ứng nhẹ nhàng. Protein bị
cắt mạch thành các đơn vị nhỏ hơn như peptid hay acid amin.
Cách tác động: Endoprotease tiến hành tách các liên kết peptid ở bên trong của nhánh polypeptid, trong khi exopeptidase tách rời các amino acid ở vị trí đầu tiên và cuối cùng của nhánh polypeptid.
Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc độ
thủy phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian. Phản ứng thủy phân tạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme. Độ thủy phân tối