3.7.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE chitosanase
pH có ảnh hưởng lớn đến vận tốc phản ứng enzyme, do đó sự thay đổi pH cũng
làm cho hoạt tính xúc tác của enzyme thay đổi. Ở pH mà tại đó trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất thể hiện một cách tốt nhất được gọi là pH thích hợp. Như vậy một
enzyme có thể có một giá trị pH thích hợp hoặc một khoảng pH thích hợp.
Hình 3.8a. Dịch enzyme chitosanase sau khi ly tâm loại tế bào
Hình 3.8b. Dịch enzyme chitosanase sau khi kết tủa bằng aceton 75%
Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE chitosanase
0 10 20 30 40 50 60 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 pH Hoạt đ ộ chito sanase, U/g CP E
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ của chitosanase tăng dần khi pH tăng từ 3,5 đến 5,0. Cụ thể, hoạt độ chitosanase ở pH 3,5 là 30,82 U/g CPE; ở pH 4,5 là 39,67 U/g CPE và ở pH 5,0 thì hoạt độ là 48,52 U/g CPE; tăng khoảng 57% so với hoạt độ
của enzyme ở pH 3,5. Tuy nhiên khi pH tăng lên 5,5 thì hoạt độ của enzyme lại giảm
xuống còn 34,03 U/g CPE.
Như vậy pH thích hợp cho hoạt động của enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 nằm trong khoảng từ 4,5 đến 5,0. Kết quả này cho thấy
khoảng pH thích hợp của chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 cũng
gần tương tự như khoảng pH thích hợp của chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037 (khoảng pH thích hợp của chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037 là 4,5 - 6,0) do Masaru Mitsutomi (1997), Đại học Saga, Nhật Bản nghiên cứu [33], [39] và
cao hơn pH thích hợp cho hoạt động của chitosanase từ Matsuebacter chitosanotabidus 3001 pH ( thích hợp của chitosanase từ Matsuebacter chitosanotabidus 3001 là 4,0) do Jae Kweon Park, Kumiko Shimono, Nobuhisa Ochiai, Kazutaka Shigeru, Masako Kurita, Yukari Ohta, Katsunori Tanaka, Hideyuki Matsuda, và Makoto Kawamukai (1999), Đại họcShimane, Nhật Bản nghiên cứu [27].
pH môi trường có ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme là do [3]: - pH làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc tâm hoạt động của enzyme.
- pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất, tại pH tối thích phân tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme. Nhờ đó
phản ứng có vận tốc cao nhất.
Hoạt độ của enzyme cũng phụ thuộc vào trạng thái bền của protein, ở pH quá cao
3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase
Khi nhiệt độ tăng từ 30 ± 1oC lên 45 ± 1oC thì hoạt độ của chitosanase tăng lên
và đạt giá trị cực đại ở nhiệt độ thủy phân là 45 ± 1oC. Cụ thể, ở 40 ± 1oC và 45 ± 1oC hoạt độ của chitosanase là 55,28 U/g CPE và 63,68 U/g CPE; trong khi ở 30 ± 1oC hoạt độ của chitosanase chỉ có 41,25 U/g CPE. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên 50 ± 1oC, 55 ± 1oC và 60 ± 1oC thì hoạt độ của chitosanase giảm mạnh từ 63,68 U/g CPE (ở 45±
1oC) xuống chỉ còn 45,17 U/g CPE; 24,83 U/g CPE và 14,76 U/g CPE.
Như vậy khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chitosanase từ
Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 là 40 - 45oC, cao hơn so với nhiệt độ tối thích
cho hoạt động của chitosanase từ Matsuebacter chitosanotabidus 3001 (nhiệt độ tối
thích của chitosanase từ Matsuebacter chitosanotabidus 3001 trong khoảng 30 - 40oC) do Jae Kweon Park, Kumiko Shimono, Nobuhisa Ochiai, Kazutaka Shigeru, Masako Kurita, Yukari Ohta, Katsunori Tanaka, Hideyuki Matsuda, và Makoto Kawamukai (1999), Đại học Shimane, Nhật Bản nghiên cứu [27].
Qua đây có thể thấy vận tốc của phản ứng enzyme càng tăng khi tăng nhiệt độ
là do khi nhiệt độ tăng, các phân tử cơ chất và enzyme chuyển động hỗn độn hơn, va
chạm, tiếp xúc với nhau nhiều hơn do đó vận tốc phản ứng xảy ra nhanh hơn nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó khi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận
tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của protein. Khi bắt đầu có sự biến
tính protein thì xảy ra hai hiện tượng: một mặt vận tốc phản ứng vẫn tăng theo sự tăng
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase
0 10 20 30 40 50 60 70 30 35 40 45 50 55 60 Nhi ệt độ, độ C Hoạt đ ộ chito sanase, U/g CP E
nhiệt độ, mặt khác vận tốc biến tính protein xảy ra nhanh hơn. Kết quả là vận tốc phản ứng giảm dần tới đình chỉ hoàn toàn.
3.8. Kết quả sử dụng chế phẩm enzyme chitosanase để thủy phân dung dịch chitosan 1% chitosan 1%
Mẫu 1: bổ sung 0,1g chế phẩm enzyme chitosanase vào 100ml dung dịch chitosan 1%
Mẫu 2: bổ sung 0,2g chế phẩm enzyme chitosanase vào 100ml dung dịch chitosan 1%
Mẫu 3: bổ sung 0,3g chế phẩm enzyme chitosanase vào 100ml dung dịch chitosan 1%
Mẫu 4: bổ sung 0,4g chế phẩm enzyme chitosanase vào 100ml dung dịch chitosan 1%
Mẫu 5: bổ sung 0,5g chế phẩm enzyme chitosanase vào 100ml dung dịch chitosan 1%
pH dịch thủy phân được điều chỉnh về giá trị pH = 5,0 (là giá trị thích hợp cho hoạt động của enzyme chitosanase Streptomyces griseus VTCC-A-1126, được xác
định từ kết quả của các thí nghiệm trên).
Tiến hành thủy phân trên máy lắc ổn nhiệt Shel lab (150 vòng/phút), điều chỉnh
nhiệt độ của máy là 45o (là giá trị nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme
chitosanase Streptomyces griseus VTCC-A-1126, được xác định từ kết quả của các thí nghiệm trên).
Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, càng tăng tỷ lệ CPE chitosanase bổ sung
vào 100ml dung dịch chitosan 1% thì mức độ thủy phân càng mạnh. Khi thời gian tăng
lên thì hỗn hợp thủy phân càng nhanh chuyển sang trạng thái dịch lỏng và độ nhớt
giảm mạnh, đặc biệt là trong giai đoạn đầu. Cụ thể, trong 2 giờ đầu, độ nhớt của hỗn
hợp thủy phân giảm mạnh từ 142,15 mPa.s xuống còn 13,63 mPa.s; 9,34 mPa.s; 8,09 mPa.s; 7,17 mPa.s; 6,34 mPa.s tương ứng ở mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3, mẫu 4 và mẫu 5.
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 110.00 120.00 130.00 140.00 150.00 0 2 6 8 16 20 24
Thời gian, giờ Độ nhớt, mPa.s Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 120 40 30 20 10 0 0 2 6 8 16 20 24
Đến giờ thứ 8 thì độ nhớt lần lượt ở các mẫu 1, 2, 3, 4 và 5 là 4,37 mPa.s; 3,43 mPa.s; 2,89 mPa.s; 2,69 mPa.s; 2,65 mPa.s. Ở giờ thứ 16 trở đi thì độ nhớt lần lượt ở các mẫu
1, 2, 3, 4 là 2,07 mPa.s; 1,50 mPa.s; 1,45 mPa.s; 1,30 mPa.s; 1,28 mPa.s và đến giờ
thứ 24 thì độ nhớt lần lượt ở các mẫu 1, 2, 3, 4 và 5 chỉ còn 1,58mPa.s; 1,37mPa.s; 1,31mPa.s; 1,17mPa.s; 1,18mPa.s.
Độ nhớt của hỗn hợp thủy phân ở mẫu 4 và mẫu 5 theo thời gian thủy phân
không có sự khác biệt nhiều. Cụ thể: ở giờ thứ 6, độ nhớt ở mẫu 4 và mẫu 5 lần lượt là là 2,82 mPa.s và 2,79 mPa.s; và đến giờ thứ 20, độ nhớt ở mẫu 4 là 1,25 mPa.s, ở mẫu
5 là 1,20 mPa.s.
Từ các phân tích ở trên cho thấy khi tăng tỷ lệ bổ sung CPE chitosanase vào hỗn hợp thủy phân trong khoảng từ 0,1-0,4g/100 ml dung dịch chitosan 1% thì tốc độ
thủy phân tăng tỉ lệ thuận với lượng enzyme bổ sung vào hỗn hợp. Khi tăng tỷ lệ bổ
sung CPE chitosanase vào hỗn hợp thủy phân lên 0,5g/100 ml dung dịch chitosan 1%
thì độ nhớt của dung dịch thủy phân không giảm nhiều hơn so với mẫu chỉ bổ sung
0,4g/100 ml dung dịch chitosan 1%. Như vậy, bổ sung 0,4g CPE chitosanase vào 100 ml dung dịch chitosan 1% để thủy phân là phù hợp hơn cả.
Như vậy sau 24 giờ sử dụng CPE chitosanase thủy phân chitosan 1% ở 45oC thì
độ nhớt ở các mẫu 1, 2, 3, 4, 5 giảm rất mạnh; lần lượt là 98,88%; 99,03%; 99,07%; 99,17% và 99,17% so với độ nhớt ban đầu. Trong khi đó, nếu dùng papain thủy phân
thì độ nhớt chỉ giảm 66% sau 48 giờ ở 25oC, còn dùng HCl để thủy phân thì phải mất
20 ngày mới đạt được kết quả tương tự[33]
Hiệu suất của quá trình thủy phân chitosan 1% thành glucosamine ở mẫu 4 sau 24 giờ là 94,14%. CPE chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 có khả năng thủy phân chitosan (độ deacetyl 95%) rất nhanh và hiệu suất của quá trình thủy
phân khá cao (94,14%). Theo Trần Thị Luyến [15] thì khi sử dụng papain thủy phân
chitin, chitosan cho hiệu suất thu COS rất cao từ 95-97%; nhưng khi sử dụng cellulase
chiết từ xạ khuẩn thủy phân chitin, chitosan cho hiệu suất thu COS lại rất thấp 52%.
Ngoài ra, cũng có thể dùng hemicellulase, lysozyme và lipase để thủy phân chitin,
chitosan với hiệu suất thu hồi COS lần lượt là 85%, 72% và 76% [33].
Tóm lại: chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A – 1126 là enzyme thủy
enzyme chitosanase trong 100ml dung dịch chitosan) thì độ nhớt giảm 99,17% và hiệu
suất tạo thành glucosamine là 94,14%.
3.9. Quy trình thu chế phẩm chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus VTCC -
A - 1126
Sơđồ quy trình
Thuyết minh quy trình - Nuôi cấy:
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được bảo quản ở 5oC trên môi trường giữ giống chứa: Peptone: 2%; Yeast extract: 1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; Tinh bột thô hòa tan: 1%; Agar: 1,8%.
Sau khi đã phân lập và chọn được các khuẩn lạc to, rời tiến hành nuôi
Streptomyces griseus VTCC-A-1126trong môi trường bao gồm các thành phần sau: - Peptone : 2%
- Yease extract : 1%
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Nuôi cấy
Ly tâm thu tế bào
Nuôi sinh enzyme chitosanase Ly tâm Dịch chứa enzyme Kết tủa Chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật Aceton 75%
- MgSO4.7H2O : 0,05% - Tinh bột thô hòa tan : 2%
Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng, chuẩn pH môi trường về 7,0 đem
thanh trùng ở 121oC/15 phút, sau đó để nguội. Dùng que cấy cấy khuẩn lạc của
Streptomyces griseus VTCC-A-1126 vào bình tam giác đựng môi trường nuôi cấy. Đem nuôi trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.
- Ly tâm thu tế bào:
Sau thời gian nuôi cấy từ 42 - 48 giờ, tiến hành ly tâm (tốc độ: 5.000 vòng/phút, thời gian: 15 phút) để thu sinh khối tế bào và chuyển sang môi trường nuôi sinh enzyme chitosanase.
- Nuôi sinh enzyme chitosanase
Chuẩn bị dịch môi trường nuôi cấy sinh enzyme chitosanase bao gồm:
Peptone: 1%; KCl: 0,05%; K2HPO4: 0,1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; FeSO4: 0,001%; chitosan: 1%. pH = 5,0
Sau đó đem thanh trùng môi trường ở ở 121oC/15 phút và để nguội.
Tiến hành chuyển sinh khối Streptomyces griseus VTCC-A-1126 sau khi ly tâm vào môi trường nuôi sinh enzyme chitosanase đã chuẩn bị ở trên và nuôi trên máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 3 ngày.
- Ly tâm thu dịch chứa enzyme
Sau 3 ngày nuôi sinh enzyme chitosanse tiến hành ly tâm lạnh (tốc độ 9.000 vòng/phút, thời gian: 15 phút) để thu dịch chứa enzyme chitosanase.
- Kết tủa thu chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật
Dùng aceton 99,5% đưa vào dung dịch chứa enzyme chitosanase để đạt được
nồng độ là 75%, nhiệt độ kết tủa là 4oC. Sau thời gian là 24 giờ, loại bỏ dung môi và thu kết tủa là CPE chitosanase. Sau đó đem CPE chitosanase kỹ thuật đi bảo quản lạnh để sử dụng.
CPE chitosanase kỹ thuật thu được có hoạt độ là 35,948 U/g CPE. Sử dụng
CPE chitosanase kỹ thuật để thủy phân dung dịch chitosan 1% ở 45oC (tỷ lệ bổ sung là 0,4g/100 ml dung dịch chitosan 1%) thì sau 24 giờ, độ nhớt giảm 99,17% và hiệu suất
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau:
- Mannitol và tinh bột thô hòa tan là hai hợp chất có chứa cacbon thích hợp cho
sự sinh trưởng và phát triển của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126, trong đó thì tinh bột thô hòa tan có giá thành thấp hơn mannitol. Do đó có thể lựa chọn tinh bột thô hòa tan để nuôi cấy thu sinh khối Streptomyces griseus VTCC - A - 1126. Thời điểm
thích hợp để thu sinh khối tế bào là trong khoảng thời gian từ 42 đến 48 giờ nuôi cấy.
- Nồng độ chitosan thích hợp để bổ sung vào môi trường nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 để sinh tổng hợp enzyme chitosanase là 1%.
- Để thu được dịch thể có hoạt độ chitosanase cao thì có thể kết thúc quá trình nuôi sinh enzyme chitosanase sau 3 ngày.
- pH thích hợp cho hoạt động của enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus
VTCC - A - 1126 nằm trong khoảng từ 4,5 đến 5,0.
- Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chitosanase từ Streptomyces griseus
VTCC - A - 1126 từ 40 đến 45oC.
- Để thu được chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật có hoạt độ cao thì dùng tác nhân kết tủa là aceton 99,5% bổ sung vào dịch chứa enzyme để đạt được nồng độ
là 75% (ở 4oC).
- Tỷ lệ bổ sung chế phẩm enzyme chitosanase để thủy phân chitosan 1% là 0,4 g CPE trong 100 ml dung dịch chitosan (độ deacetyl là 95%). Sau 24 giờ, độ nhớt của
chitosan giảm 99,17%; hiệu suất của quá trình thủy phân đến glucosamine là 94,14%.
2. Đề xuất ý kiến
Qua quá trình nghiên cứu cho phép đề xuất một số ý kiến sau:
- Cần tiến hành phương pháp quy hosạch thực nghiệm để đánh giá toàn diện hơn về ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ chất cảm ứng, thời gian
nuôi cấy,... đến hoạt độ của enzyme chitosanase Streptomyces griseus VTCC - A - 1126.
- Khảo sát ảnh hưởng của các chất hoạt hóa, các chất ức chế đến hoạt độ của enzyme chitosanase như nồng độ muối, nồng độ các ion kim loại,...
- Tiếp tục nghiên cứu khả năng thủy phân của enzy me chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 đối với các loại chitosan có độ deacetyl khác nhau.
- Đề tài mới bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ
thuật từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126, cần tiếp tục nghiên cứu tinh sạch
enzyme chitosanase.
-Tiếp tục nghiên cứu thêm khả năng sinh enzyme chitosanase ở các chủng
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ Thủy sản (2003), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nhà xuất bản
nông nghiệp.
2. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme protease từ B. subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Hữu Hiệp (2006), Giáo trình vi sinh vật chuyên sâu, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
5. Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu, Nguyễn Thụy Dạ Thảo, Phan Anh Tú
(2004), “Nghiên cứu quy trình chiết tách và ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm
mật Coprinus Fimentarius”, Báo cáo tổng kết nghiệm thu sở Khoa học và Công nghệ, TP. Hồ Chí Minh.
6. Đặng Văn Hợp (2000), Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất protease từ Asperigillus oryzae A4 và ứng dụng vào sản xuất nước mắm, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
7. Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Chikafusa Fukazawa (1999), “Nghiên cứu tinh chế và xác định tính chất của chitinase từ đậu tương”, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội.
8. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2003), Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại học Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003), Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất bản