[22], [31], [38]
Chitin, Chitosan là các polysaccharide chứa đạm không độc hại, có khối lượng
phân tử lượng lớn. Cấu trúc của chitin là một tập hợp các phân tử liên kết với nhau bởi
các cầu nối glycoside và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa Chitin rất
hiếm tồn tại ở trạng thái tự do, hầu như luôn liên kết bởi các cầu nối đẳng trị với
protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác trong vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ.
Chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị N-acetyl-beta-D- glycosamine nối với nhau nhờ cầu nối beta-1,4-glycoside.
Công thức cấu tạo:
Công thức phân tử: [C8H13O5N]n Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n
Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như ether, rượu,... Chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schweizei Sapranora. Điều này có thể do nhóm acetamin (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành các phức chất cần thiết nhưng nó lại hòa tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat
liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo.
Chitin tương đối ổn định với các chất oxy hóa khử như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Ca(ClO)2,... lợi dụng tính chất này người ta sử
dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho Chitin.
Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng λ = 884-890µm.
Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc thì Chitin sẽ bị thủy phân hoàn toàn tạo
thành 88,5% D-glucosamin và 22,5% acid acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở
mối nối glycoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3).
H O CH2OH H H OH H H H O O CH2OH OH H H HN-COCH3 H H O HN-COCH3 O CH2OH H OH H H n O H H Polypeptit O (C32H54N4O21)x + 2(H2O)x (C28H50N4O19)x + 2(CH3-COOH)x
Khi đun nóng Chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thì Chitin sẽ bị mất gốc
acetyl tạo thành Chitosan.
Chitosan là dẫn xuất đề acetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế
nhóm (HN-COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D- glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết beta-D-1,4-glycoside, do vậy chitosan
có thể gọi là poly beta-1,4-2-amino-2-deoxi-D-glucose hoặc là poly beta-1,4-D- glucosamine.
Công thức cấu tạo:
Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n
Chitosan ở dạng bột có màu trắng ngà, còn ở dạng vẩy có màu trắng hay hơi
vàng. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng tan trong
acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo dương, nhớt và trong suốt, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Pb, Hg,...
Chitosan kết hợp với aldehyde trong điều kiện thích hợp hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme.
Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng màu tím, phản ứng này có thể dùng để phân tích định tính chitosan.
Mặt khác chitin, chitosan là những polymer mà các monomer được nối với (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhau bởi các liên kết beta-D-1,4-glycoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các
chất hóa học như acid, base, tác nhân oxy-hóa và các enzyme thủy phân.
Chitosan có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, trong y – dược, trong công
nghiệp thực phẩm,...
Khi thủy phân chitin, chitosan (bằng phương pháp hóa học hoặc sinh học) thì
thu được glucosamine, N-acetylglucosamine. Glucosamine là chất kết tinh có màu trắng, vị ngọt, dễ hòa tan trong nước.
Chitin + nNaOH(đậm đặc) ChitosĐun nóng an + nCH3COONa
O CH2OH H H OH H H NH2 O CH2OH H H OH H H O H H O NH2 O CH2OH H OH H H NH2 n O H H O
Công thức cấu tạo của glucosamine:
Công thức phân tử của glucosamine: C6H13NO5
Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose chitosamine
Glucosamine (GlcN) và dẫn xuất của nó N-acetylglucosamine (GlcNAc or NAG)
được tổng hợp ở tất cả các sinh vật, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, thực vật và
động vật. Trong cơ thể con người GlcN and GlcNAc là thành phần chính của
glycosaminoglycan cấu tạo nên sụn khớp (như là hyaluronic acid, chondroitin sulfate và
keratan sulfate). GlcN và GlcNAc có vai trò sinh lý rất quan trọng đối với con người,
chúng rất cần thiết để sữa chữa và duy trì chức năng của sụn và các khớp xương, GlcN
giúp điều trị bệnh viêm khớp xương đầu gối mãn tính, khi các khớp bị tổn thương, chúng
là nguyên liệu để sản xuất các chất cần thiết như collagen, proteoglycan và glycosaminoglycan để phục hồi sụn khớp và tái cung cấp chất nhờn giúp các khớp linh
động trở lại. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào chức năng giải độc cho gan và thận, chống
viêm gan, chống dị ứng, chống thiếu oxy trong máu, chống ung thư và chữa tổn thương đường ruột và dạ dày. GlcN và GlcNAc là thuốc hầu như không có tác dụng phụ, ngay cả khi dùng lâu dài. Điều này hoàn toàn có cơ sở vì chúng chính là một chất được tổng hợp
tự nhiên trong cơ thể người, do đó được cơ thể dung nạp dễ dàng.
1.4. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITOSANASE [21], [24], [33], [36], [37], [39]
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trước kia được xếp vào tản thực vật (tức nấm) nhưng ngày nay chúng được xếp
vào vi khuẩn.
Phân loại khoa học của xạ khuẩn:
- Giới (regnum) : Bacteria - Ngành (phylum) : Actinobacteria - Lớp (class) : Actinobacteria - Phân lớp : +Acidimicrobidae +Actinobacteridae +Coriobacteridae +Rubrobacteridae +Sphaerobacteridae
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony-forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu. Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium). Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều
bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores). Nếu bào tử nằm trong
bào nang (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách
ngăn (septa). Các chuỗi bào tử trần có thể chỉ là 1 bào tử (như ở Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Promicromonospora, Micromonospora, Thermomonosspora...), có thể có 2 bào tử (như ở Microbispora), có thể là chuỗi ngắn (như ở Nocardia, Pseudonocardia, Streptoverticillium, Sporichthya, Actinomadura, Microtetraspora, Streptoalloteichus, Glycomyces, Amycolata, Amycolatopsis, Catellatospora, Microellobosporia...), có thể là chuỗi dài (như ở Streptomyces, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Kibdelosporangium, Kitasatosporia, Saccharothrix, nhiều loài ở
Nocardia, Nocardioides, Pseudonocardia, Amycolatopsis, Streptoverticillium...), có thể
các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tương tự bó sợi của nấm (như ở
Actinosynnema, Actinomadura...). Các chuỗi bào tử có thể thẳng, có thể xoắn, có thể ở
dạng lượn sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng... Các cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể riêng rẽ, có thể phân nhánh.
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao
hơn 55%. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng
100 chi và 1000 loài xạ khuẩn. Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất
quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất. Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử. Thậm
chí một số loại xạ khuẩn còn hình thành túi bào tử như chi Streptosporangium,
Micromonospora và bào tử di động như chi Actinoplanes, Kineosporia.
Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ,
35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi Streptomyces
Hình 1.8. Sự phát triển của khuẩn ti ở xạ khuẩn [36], [37]
Hình 1.9. Các loại khuẩn ti ở xạ khuẩn [36], [37]
Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự rADN 16S,
lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại. Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu
sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của
trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%.
Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn. Chúng
rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi. Đó là những đặc điểm sau: đường, loại
acetyl, acid mycolic trong thành tế bào, menaquinone, phospholipid, acid béo và tỷ lệ
GC trong ADN. Một số chi thường gặp Chi Rhodococcus Chi Nocardioides Chi Pseudonocardia Chi Saccharopolyspora Chi Intrasporangium Chi Actinopolyspora Chi Saccharomonospora
Hình 1.11. Sự hình thành chuỗi bào tử dài ở xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Frankia Chi Actinoplanes Chi Pilimelia Chi Dactylosporangium Chi Micromonospora Chi Streptomyces Chi Actinomadura Chi Microbispora Chi Streptosporangium Chi Thermomonospora Chi Actinosynnema Chi Nocardiopsis Chi Streptomyces:
Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0 µm. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử. Một
số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất. Bào tử không có khả năng di động. Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó khuẩn ty khí sinh
sẽ phát triển rất mạnh mẽ. Sinh nhiều loại sắc tố khác nhau cũng như sắc tố có khả năng khuếch tán ra môi trường. Rất nhiều chủng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất
kháng sinh. Hiếu khí, Gram dương, không nhuộm kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử nitrate thành nitrit, phân hủy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthine, tinh bột và L-tyrosine. Có khả năng sử
dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon duy nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là
25-35 oC, pH tối ưu là 6,5-8,0. Thành tế bào chứa L-DAP, không chứa acid mycolic.
Thành phần acid béo gồm phần lớn acid béo bão hòa, iso- và anteiso-. Thành phần
menaquinone chính là MK-9(H6), MK-9(H8). Thành phần phospholipid chính là diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol mannoside. Có nhiều trong đất, phân compôt. Một số loài gây bệnh cho người và động vật, một số loài gây bệnh ở thực vật. Tỷ lệ mol GC trong
ADN là 69-78%.
Streptomyces griseus là chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp chitosanase khi chúng được nuôi trong môi trường có chất cảm ứng là chitosan [33], [39].
Năm 1996, Edward M. Marcotte và cộng sự thuộc Bộ môn Hóa học và Hóa
sinh, Đại học Austin, Texas, Mỹ đã tìm ra cấu trúc X-ray của một loại chitosanase từ
chủng Streptomyces sp. N174 [24].
Năm 1997, Masaru Mitsutomi thuộc Bộ môn Khoa học sinh học ứng dụng,
Khoa Nông nghiệp, Đại học Saga, Nhật Bản đã nghiên cứu tinh sạch chitosanase từ
Streptomyces griseus HUT 6037. Streptomyces griseus HUT 6037 có thể tạo ra
chitosanase ngoại bào khi phát triển trong môi trường có chứa chitosan. Enzyme này có pH tối thích trong khoảng từ 4,5 - 6,0 [33], [39].
Năm 2003, Tanabe và các cộng sự đã mô tả hai loại enzyme chitosanase từ
Streptomyces griseus HUT 6037. Hai loại enzyme chitosanase này (ChoI và ChoII) vừa có
khả năng thủy phân chitosan vừa có khả năng thủy phân cả carb oxymethylcellulose [39].
Từ các dẫn liệu khoa học cho thấy chi Streptomyces nói chung và chủng
Streptomyces griseus nói riêng có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase ngoại
bào khi phát triển trong môi trường có chitosan. Do đó chúng tôi chọn Streptomyces griseus là đối tượng nghiên cứu nuôi sinh enzyme chitosanase.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Streptomyces griseus là chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp chitosanase khi chúng được nuôi trong môi trường có chất cảm ứng là chitosan [33], [39]. Chúng tôi nghiên cứu sự sản sinh chitosanase của Streptomyces griseus VTCC-A-1126
được lấy từ phòng bảo tồn giống vi sinh vật thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội ở dạng đông khô, được chuyển về Nha Trang bằng máy bay và được bảo quảnở 4oC.
Hình 2.1. Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Hình 2.2. Streptomyces griseus VTCC-
A-1126 được nhuộm xanh mêtylen
Hình 2.3. Streptomyces griseus VTCC-
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 này được sử dụng để nghiên cứu
sản xuất chitosanase theo phương pháp nuôi cấy lỏng. Sau khi dừng quá trình nuôi, tiến hành ly tâm loại bỏ tế bào để thu dịch thể chứa chitosanase và dùng các tác nhân kết tủa để kết tủa enzyme thu chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Chitosan
Độ deacetyl : 95%
Độ ẩm : 12%
Hàm lượng Ca2+ : 0,01%
Hàm lượng chất không tan : 0,18%
Hàm lượng nitơ tổng số : 8,42%
Độ tan : 99,82% (Trong acid acetic 1,5%)
Phản ứng Biure : âm tính
Chitosan được lấy từ Trung tâm Chế biến, Đại học Nha Trang.
Các hóa chất: albumin, yeast extract, pepto ne, starch soluble (tinh bột thô hòa tan), D- mannitol, glucose, saccarose, p-dimethylaminobenzaldehyde, glucosamine hydrochloride, kali natri tartrat, natri wonf ramat, natri molypdat, và một số hóa chất khác.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định hoạt tính của enzyme chitosanase [9], [16]
Hoạt tính của enzyme chitosanase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm glucosamin của quá trình phân giải chitosan. Một đơn vị hoạt tính được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1µg glucosamin trong thời
gian một phút ở nhiệt độ 30oC.
2.2.2. Xác định hàm lượng đường glucosamin theo Elson-Morgan [9], [16]
Phương pháp này dựa trên sự hình thành các chất dẫn xuất pyrrole khi
glucosamin được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrole này sẽ cho
phản ứng màu với thuốc thử Ehrlich.
Đường amin hydrochlorid được đun nóng với acetyl aceton trong dung dịch
kiềm khoảng 1 giờ trước khi thêm thuốc thử Ehrlich. Những lượng tương đương
2.2.3. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry [9], [16]
Nguyên tắc của phương pháp này là tính hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của protein và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc
thử Folin-Ciocalteau. Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein.
2.2.4. Xác định số lượng tế bào theo phương pháp đếm khuẩn lạc (phương pháp đếm đĩa) [1], [8] đếm đĩa) [1], [8]
Tế bào sống được xác định như một tế bào có khả năng phân chia, sinh sản. Cách thường dùng để tính số tế bào sống là xác định số tế bào trong mẫu có khả năng
tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch thích hợp. Vì lẽ này, phương pháp xác định số lượng tế bào sống như trên gọi được gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hay phương pháp đếm đĩa (plate count).
2.2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126 chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Nuôi cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ly tâm thu tế bào
Nuôi sinh enzyme chitosanase Ly tâm Dịch chứa enzyme Kết tủa Chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật
- Môi trường có nguồn cacbon khác nhau (Glucose,
Saccharose, Mannitol, Tinh bột).
- Xác định môi trường có nguồn
cacbon thích hợp
- Môi trường nuôi cấy có
nồng độ chất cảm ứng - chitosan - khác nhau (0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%). - Thời gian - Tác nhân kết tủa: + Loại tác nhân + Nồng độ
1. Nghiên cứu nguồn cacbon nuôi cấy thu sinh khối Streptomyces griseus VTCC-
A-1126 thích hợp
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được bảo quản ở 5oC trên môi
trường giữ giống chứa: Peptone: 2%; Yeast extract: 1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; Tinh bột thô hòa tan: 1%; Agar: 1,8%.
Sau khi đã phân lập và chọn được các khuẩn lạc to, rời tiến hành nuôi Streptomyces griseus VTCC-A-1126trong môi trường có các nguồn cacbon khác nhau.