2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Streptomyces griseus là chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp chitosanase khi chúng được nuôi trong môi trường có chất cảm ứng là chitosan [33], [39]. Chúng tôi nghiên cứu sự sản sinh chitosanase của Streptomyces griseus VTCC-A-1126
được lấy từ phòng bảo tồn giống vi sinh vật thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội ở dạng đông khô, được chuyển về Nha Trang bằng máy bay và được bảo quảnở 4oC.
Hình 2.1. Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Hình 2.2. Streptomyces griseus VTCC-
A-1126 được nhuộm xanh mêtylen
Hình 2.3. Streptomyces griseus VTCC-
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 này được sử dụng để nghiên cứu
sản xuất chitosanase theo phương pháp nuôi cấy lỏng. Sau khi dừng quá trình nuôi, tiến hành ly tâm loại bỏ tế bào để thu dịch thể chứa chitosanase và dùng các tác nhân kết tủa để kết tủa enzyme thu chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Chitosan
Độ deacetyl : 95%
Độ ẩm : 12%
Hàm lượng Ca2+ : 0,01%
Hàm lượng chất không tan : 0,18%
Hàm lượng nitơ tổng số : 8,42%
Độ tan : 99,82% (Trong acid acetic 1,5%)
Phản ứng Biure : âm tính
Chitosan được lấy từ Trung tâm Chế biến, Đại học Nha Trang.
Các hóa chất: albumin, yeast extract, pepto ne, starch soluble (tinh bột thô hòa tan), D- mannitol, glucose, saccarose, p-dimethylaminobenzaldehyde, glucosamine hydrochloride, kali natri tartrat, natri wonf ramat, natri molypdat, và một số hóa chất khác.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định hoạt tính của enzyme chitosanase [9], [16]
Hoạt tính của enzyme chitosanase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm glucosamin của quá trình phân giải chitosan. Một đơn vị hoạt tính được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1µg glucosamin trong thời
gian một phút ở nhiệt độ 30oC.
2.2.2. Xác định hàm lượng đường glucosamin theo Elson-Morgan [9], [16]
Phương pháp này dựa trên sự hình thành các chất dẫn xuất pyrrole khi
glucosamin được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrole này sẽ cho
phản ứng màu với thuốc thử Ehrlich.
Đường amin hydrochlorid được đun nóng với acetyl aceton trong dung dịch
kiềm khoảng 1 giờ trước khi thêm thuốc thử Ehrlich. Những lượng tương đương
2.2.3. Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry [9], [16]
Nguyên tắc của phương pháp này là tính hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của protein và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc
thử Folin-Ciocalteau. Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ protein.
2.2.4. Xác định số lượng tế bào theo phương pháp đếm khuẩn lạc (phương pháp đếm đĩa) [1], [8] đếm đĩa) [1], [8]
Tế bào sống được xác định như một tế bào có khả năng phân chia, sinh sản. Cách thường dùng để tính số tế bào sống là xác định số tế bào trong mẫu có khả năng
tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch thích hợp. Vì lẽ này, phương pháp xác định số lượng tế bào sống như trên gọi được gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hay phương pháp đếm đĩa (plate count).
2.2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126 chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Nuôi cấy
Ly tâm thu tế bào
Nuôi sinh enzyme chitosanase Ly tâm Dịch chứa enzyme Kết tủa Chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật
- Môi trường có nguồn cacbon khác nhau (Glucose,
Saccharose, Mannitol, Tinh bột).
- Xác định môi trường có nguồn
cacbon thích hợp
- Môi trường nuôi cấy có
nồng độ chất cảm ứng - chitosan - khác nhau (0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%). - Thời gian - Tác nhân kết tủa: + Loại tác nhân + Nồng độ
1. Nghiên cứu nguồn cacbon nuôi cấy thu sinh khối Streptomyces griseus VTCC-
A-1126 thích hợp
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được bảo quản ở 5oC trên môi
trường giữ giống chứa: Peptone: 2%; Yeast extract: 1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; Tinh bột thô hòa tan: 1%; Agar: 1,8%.
Sau khi đã phân lập và chọn được các khuẩn lạc to, rời tiến hành nuôi Streptomyces griseus VTCC-A-1126trong môi trường có các nguồn cacbon khác nhau.
Môi trường nuôi cấy lỏng gồm:
- Peptone : 2% - Yease extract : 1% - MgSO4.7H2O : 0,05%
- Nguồn cacbon : sử dụng một trong các nguồn cacbon sau: + Saccharose : 2%
+ Glucose : 2% + Mannitol : 2% + Tinh bột thô hòa tan : 2%
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của chi Streptomyces là 25-35 oC, pH tối ưu là 6,5-8,0 [36],[37]. Do đó, sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng, chuẩn pH môi trường về 7,0 đem thanh trùng ở 121oC/15 phút, sau đó để nguội. Dùng que cấy cấy khuẩn lạc
của Streptomyces griseus VTCC-A-1126vào bình tam giác đựng môi trường nuôi cấy. Đem nuôi trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.
Sau thời gian nuôi cấy là 48 giờ tiến hành xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc hình thành tương ứng trên các môi trường có nguồn cacbon khác
nhau để tìm nguồn cacbon thích hợp cho quá trình nuôi thu sinh khối.
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Nuôi cấy ở các môi trường có nguồn cacbon
khác nhau
Xác định số lượng tế
bào
Nguồn cacbon thích
2. Xác định thời điểm thu sinh khối Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng gồm:
- Peptone : 2% - Yease extract : 1% - MgSO4.7H2O : 0,05%
- Nguồn cacbon : được xác định dựa vào kết quả của thí nghiệm trước Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng, chuẩn pH môi trường về 7,0 đem
thanh trùng ở 121oC/15 phút, sau đó để nguội. Dùng que cấy cấy khuẩn lạc của
Streptomyces griseus VTCC-A-1126 vào bình tam giác đựng môi trường nuôi cấy. Đem nuôi trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.
Cứ sau 2h tiến hành xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Từ đó xây dựng đường cong sinh trưởng của Streptomyces griseus VTCC-A-1126 và xác định thời gian kết thúc quá trình nuôi cấy thu sinh khối Streptomyces griseus
VTCC-A-1126.
3. Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - chitosan - trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Để xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase tiến hành xác định
hoạt độ của enzyme chitosanase. Một đơn vị hoạt độ được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1µg glucosamine trong thời gian một phút ở nhiệt độ 30oC [3], [9].
Chuẩn bị dịch môi trường nuôi cấy sinh enzyme chitosanase bao gồm: Peptone:
1%; KCl: 0,05%; K2HPO4: 0,1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; FeSO4: 0,001%; nồng độ chất
cảm ứng (chitosan) thay đổi lần lượt là 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%.
Tiến hành nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC-A-1126 ở các môi trường có
nồng độ chitosan khác nhau. Sau đó xác định hoạt độ enzyme chitosanase đối với từng
nồng độ chất cảm ứng sau thời gian nuôi cấy là 3 ngày. Từ đó xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp.
4. Nghiên cứu xác định thời gian nuôi sinh enzyme chitosanase thích hợp
Tiến hành nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC-A-1126 trong môi trường nuôi cấy sinh enzyme chitosanase bao gồm: Peptone: 1%; KCl: 0,05%; K2HPO4: 0,1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; FeSO4: 0,001%; nồng độ chất cảm ứng (chitosan) đã được xác
định từ kết quả của thí nghiệm trên (thí nghiệm 3).
Sau mỗi ngày nuôi cấy, tiến hành xác định hoạtđộ enzyme chitosanase, từđó xác
định thời gian nuôi cấy sinh enzyme chitosanase thích hợp từ Streptomyces griseus
VTCC-A-1126.
5. Xác định loại tác nhân kết tủa thích hợp
Cố định thời gian kết tủa = 24h, nhiệt độ kết tủa to = 4oC, sử dụng ba tác nhân
kết tủa khác nhau: Ethanol 70%, Aceton 70% và (NH4)2SO4 bão hòa.
Sử dụng ethanol 96% và aceton 99,5% (đã được làm lạnh xuống 4oC) cho từ từ
vào dịch chứa enzyme để đạt được nồng độ là 70%. Tế bào Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Nuôi sinh enzyme chitosanase
Xác định hoạt độ
chitosanase
Thời gian nuôi sinh
enzyme thích hợp
6. Xác định nồng độ chất kết tủa thích hợp
Cố định thời gian kết tủa = 24h, nhiệt độ kết tủa to = 4oC, chất kết tủa thích
hợp đã tìm được ở thí nghiệm trên.
Dịch chứa enzyme Kết tủa bằng Ethanol Aceton (NH4)2SO4 Xác định hoạt độ enzyme chitosanase Tác nhân kết tủa thích hợp Dịch chứa enzyme Kết tủa Tác nhân kết tủa Xác định hoạt độ enzyme chitosanase Nồngđộ chất kết tủa (%) 60 65 70 75 80 Nồngđộ chất kết tủa thích hợp
2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện ảnh hưởng đến hoạt độ chitosanase 1. Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ chitosanase
Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
2. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ chitosanase
Xác định nhiệt độ thích hợp (topt) cho hoạt độ chitosanase bằng cách cho
chitosanase tác dụng với cơ chất chitosan ở các nhiệt độ khác nhau: 30 ± 1oC, 35 ± 1oC, 40 ± 1oC, 45 ± 1oC, 50 ± 1oC, 55 ± 1oC, 60 ± 1oC rồi xác định hoạt độ
chitosanase. Từ đó kết luận nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme chitosanase
từ Streptomyces griseus VTCC-A-1126.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm như sau:
CPE chitosanase
Xác định hoạt độ
chitosanase
Cho tác dụng với chitosan ở các pH
3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 Chọn pHopt cho enzyme CPE chitosanase Xác định hoạt độ chitosanase
Cho tác dụng với chitosan ở các to
30 ± 1oC
Chọn topt cho enzyme
2.2.7. Áp dụng thủy phân chitosan bằng enzyme chitosanase
Tiến hành bổ sung lần lượt 0,1g; 0,2g; 0,3g; 0,4g; 0,5g chế phẩm enzyme
chitosanase kỹ thuật vào 100 ml dung dịch chitosan 1%, điều chỉnh pH dịch thủy phân
về giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzyme chitosanase Streptomyces griseus
VTCC-A-1126(đã xác định ở thí nghiệm trên). Tiến hành thủy phân trên máy lắc ổn
nhiệt Shel lab (150 vòng/phút), điều chỉnh nhiệt độ thủy phân về nhiệt độ thích hợp
cho hoạt động của enzyme chitosanase Streptomyces griseus VTCC-A-1126 (đã xác
định ở thí nghiệm trên). Cứ sau sau 2 - 4 giờ tiến hành đo độ nhớt của dịch thủy phân.
Từ đó xác định tỷ lệ chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật thích hợp cho quá trình thủy phân.
2.3. Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng
- Nồi thanh trùng (labo - autoclave) MLS - 2420 Sanyo - Tủ sấy - Memmert
- Tủ an toàn vi sinh vật (Biological Safety Cabinets) – Nuaire - Tủ cấy vi sinh Totelstar AV 100 – Model PV 100-16195 - Tủ nuôi cấy tế bào điều nhiệt tự động (incubator) - Sanyo - Tủấm nóng lạnh (incubator) - Sanyo
- Máy ly tâm Rotina 35 - Hettich có thể ly tâm 16.500 vòng/phút - Máy lắc đa năng SO1 (Orbital Shaker SO1) - Stuart - Bibby - Máy lắc ổn nhiệt có làm lạnh - Shel lab
- Bểổn nhiệt - Huber
- Cân phân tích kỹ thuật Precisa loại 2200g và 220g độ chính xác 10-6g - Máy đo pH - pH Meter- Metrohm
- Quang phổ kế DR/2000 (Direct Reading Spectrophotometer) - Hach - Nhớt kế Rotor (Rotational Viscometer) NDJ - 1
- Máy khuấy từ gia nhiệt RT5
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định nguồn cacbon nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC-A-1126 để thu sinh khối tế bào sinh khối tế bào
Sau thời gian nuôi cấy là 48 giờ trên máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút) ở điều kiện
nhiệt độ phòng, tiến hành xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và ly tâm xác định khối lượng tế bào tương ứng ở các môi trường nuôi cấy có nguồn
cacbon khác nhau. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.1 và 3.2.
3,5E +11 0 5E+10 1E+11 1.5E+11 2E+11 2.5E+11 3E+11 3.5E+11
Glucose Saccharose Manitol Tinh bột
hòa tan Nguồn cacbon CFU 3,0E +11 2,5E +11 2,0E +11 1,5E +11 1,0E +11 0,5E +11
Hình 3.1. Số lượng khuẩn lạc của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126
trong các môi trường có nguồn cacbon khác nhau
35.1010 30.1010 25.1010 20.1010 15.1010 10.1010 5.1010 Mannitol Tinh bột
thô hòa tan
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Glucose Saccharose Manitol Tinh bột
hòa tan Nguồn cacbon Khối lư ợng tế b ào, g/1 00ml
Hình 3.2. Khối lượng tế bào trong các môi trường có nguồn cacbon khác nhau
1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,2 0,4 0 Mannitol Tinh bột
Nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung và của chủng Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 nói riêng. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 4 loại hợp chất chứa
cacbon khác nhau đó là glucose, saccharose, mannitol và tinh bột thô hòa tan đến khả
năng sinh trưởng và phát triển củaStreptomyces griseus VTCC - A - 1126.
Từ hình 3.1 và 3.2 cho thấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của
Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 trên môi trường có chứa mannitol hoặc tinh bột thô hòa tan tốt hơn so với trên môi trường có chứa glucose và saccharose. Cụ thể, sau 48 giờ nuôi cấy, số lượng khuẩn lạc được tạo thành trên môi trường có chứa
mannitol là 30.1010 CFU, trong môi trường có chứa tinh bột thô hòa tan là 28.1010 CFU, trong môi trường có chứa saccharose là 120.109 CFU và trong môi trường có chứa glucose là 167.109 CFU. Khối lượng tế bào thu được sau khi ly tâm 100 ml dịch
nuôi cấy có các nguồn cacbon là mannitol, tinh bột thô hòa tan cũng nhiều hơn là glucose và saccharose; tương ứng là 1,5 g; 1,4 g; 0,94 g và 0,6 g.
Số lượng khuẩn lạc được tạo thành cũng như khối lượng tế bào thu được khi nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 trên môi trường có chứa mannitol hoặc tinh bột thô hòa tan đều cao hơn so với khi nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 trên môi trường có chứa glucose hoặc saccharose. Nói chung, vi sinh vật sẽ
sử dụng nguồn cacbon đơn giản và dễ hấp thụ trước, nguồn cacbon phức tạp sau. Điều
này phù hợp với kết quả nghiên cứu khi nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 trên môi trường có chứa mannitol và glucose thì chúng sinh trưởng và phát triển
tốt hơn trên môi trường có chứa saccharose. Tuy nhiên, từ kết quả cũng cho thấy tuy tinh bột thô hòa tan là hợp chất có phân tử lượng lớn hơn glucose và saccharose nhưng trên môi trường có tinh bột thô hòa tan thì Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 lại
có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt hơn trên môi trường có chứa glucose hoặc
saccharose. Điều này có thể giải thích là do khả năng đồng hóa nguồn cacbon của
Streptomyces griseus VTCC - A - 1126, chúng có khả năng phân giải tinh bột thô hòa tan và sử dụng sản phẩm thủy phân để sinh trưởng và phát triển. Ngoài ra, trong tinh bột thô hòa tan còn chứa nhiều vitamin (đặc biệt là vitamin nhóm B như B1, B2, B6) và nhiều chất khác do đó sẽ kích thích sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme của
Như vậy, mannitol và tinh bột thô hòa tan là hai hợp chất có chứa cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126, trong
đó thì tinh bột thô hòa tan có giá thành thấp hơn mannitol. Do đó đề tài chọn tinh bột
thô hòa tan để nuôi cấy thu sinh khốiStreptomyces griseus VTCC - A - 1126.
3.2. Xác định thời gian thu nhận sinh khối thích hợp
Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, quần thể vi sinh vật nói chung và Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 nói riêng sẽ sinh trưởng và phát triển qua bốn pha liên tiếp
nhau [21]: pha lag, pha log, pha ổnđịnh và pha tử vong.
Pha lag (tiền pha) được tính từ lúc bắt đầu cấyđến khi vi sinh vật đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag, tế bào vi sinh vật chưa phân chia (chưa có khả
năng sinh sản) nhưng thể tích và trọng lượng tế bào tăng rõ rệt, do đó nếu muốn xem