A - 1126
Sơđồ quy trình
Thuyết minh quy trình - Nuôi cấy:
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được bảo quản ở 5oC trên môi trường giữ giống chứa: Peptone: 2%; Yeast extract: 1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; Tinh bột thô hòa tan: 1%; Agar: 1,8%.
Sau khi đã phân lập và chọn được các khuẩn lạc to, rời tiến hành nuôi
Streptomyces griseus VTCC-A-1126trong môi trường bao gồm các thành phần sau: - Peptone : 2%
- Yease extract : 1%
Chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126
Nuôi cấy
Ly tâm thu tế bào
Nuôi sinh enzyme chitosanase Ly tâm Dịch chứa enzyme Kết tủa Chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật Aceton 75%
- MgSO4.7H2O : 0,05% - Tinh bột thô hòa tan : 2%
Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng, chuẩn pH môi trường về 7,0 đem
thanh trùng ở 121oC/15 phút, sau đó để nguội. Dùng que cấy cấy khuẩn lạc của
Streptomyces griseus VTCC-A-1126 vào bình tam giác đựng môi trường nuôi cấy. Đem nuôi trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.
- Ly tâm thu tế bào:
Sau thời gian nuôi cấy từ 42 - 48 giờ, tiến hành ly tâm (tốc độ: 5.000 vòng/phút, thời gian: 15 phút) để thu sinh khối tế bào và chuyển sang môi trường nuôi sinh enzyme chitosanase.
- Nuôi sinh enzyme chitosanase
Chuẩn bị dịch môi trường nuôi cấy sinh enzyme chitosanase bao gồm:
Peptone: 1%; KCl: 0,05%; K2HPO4: 0,1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; FeSO4: 0,001%; chitosan: 1%. pH = 5,0
Sau đó đem thanh trùng môi trường ở ở 121oC/15 phút và để nguội.
Tiến hành chuyển sinh khối Streptomyces griseus VTCC-A-1126 sau khi ly tâm vào môi trường nuôi sinh enzyme chitosanase đã chuẩn bị ở trên và nuôi trên máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 3 ngày.
- Ly tâm thu dịch chứa enzyme
Sau 3 ngày nuôi sinh enzyme chitosanse tiến hành ly tâm lạnh (tốc độ 9.000 vòng/phút, thời gian: 15 phút) để thu dịch chứa enzyme chitosanase.
- Kết tủa thu chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật
Dùng aceton 99,5% đưa vào dung dịch chứa enzyme chitosanase để đạt được
nồng độ là 75%, nhiệt độ kết tủa là 4oC. Sau thời gian là 24 giờ, loại bỏ dung môi và thu kết tủa là CPE chitosanase. Sau đó đem CPE chitosanase kỹ thuật đi bảo quản lạnh để sử dụng.
CPE chitosanase kỹ thuật thu được có hoạt độ là 35,948 U/g CPE. Sử dụng
CPE chitosanase kỹ thuật để thủy phân dung dịch chitosan 1% ở 45oC (tỷ lệ bổ sung là 0,4g/100 ml dung dịch chitosan 1%) thì sau 24 giờ, độ nhớt giảm 99,17% và hiệu suất
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
1. Kết luận (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau:
- Mannitol và tinh bột thô hòa tan là hai hợp chất có chứa cacbon thích hợp cho
sự sinh trưởng và phát triển của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126, trong đó thì tinh bột thô hòa tan có giá thành thấp hơn mannitol. Do đó có thể lựa chọn tinh bột thô hòa tan để nuôi cấy thu sinh khối Streptomyces griseus VTCC - A - 1126. Thời điểm
thích hợp để thu sinh khối tế bào là trong khoảng thời gian từ 42 đến 48 giờ nuôi cấy.
- Nồng độ chitosan thích hợp để bổ sung vào môi trường nuôi cấy Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 để sinh tổng hợp enzyme chitosanase là 1%.
- Để thu được dịch thể có hoạt độ chitosanase cao thì có thể kết thúc quá trình nuôi sinh enzyme chitosanase sau 3 ngày.
- pH thích hợp cho hoạt động của enzyme chitosanase từ Streptomyces griseus
VTCC - A - 1126 nằm trong khoảng từ 4,5 đến 5,0.
- Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của chitosanase từ Streptomyces griseus
VTCC - A - 1126 từ 40 đến 45oC.
- Để thu được chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật có hoạt độ cao thì dùng tác nhân kết tủa là aceton 99,5% bổ sung vào dịch chứa enzyme để đạt được nồng độ
là 75% (ở 4oC).
- Tỷ lệ bổ sung chế phẩm enzyme chitosanase để thủy phân chitosan 1% là 0,4 g CPE trong 100 ml dung dịch chitosan (độ deacetyl là 95%). Sau 24 giờ, độ nhớt của
chitosan giảm 99,17%; hiệu suất của quá trình thủy phân đến glucosamine là 94,14%.
2. Đề xuất ý kiến
Qua quá trình nghiên cứu cho phép đề xuất một số ý kiến sau:
- Cần tiến hành phương pháp quy hosạch thực nghiệm để đánh giá toàn diện hơn về ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ chất cảm ứng, thời gian
nuôi cấy,... đến hoạt độ của enzyme chitosanase Streptomyces griseus VTCC - A - 1126.
- Khảo sát ảnh hưởng của các chất hoạt hóa, các chất ức chế đến hoạt độ của enzyme chitosanase như nồng độ muối, nồng độ các ion kim loại,...
- Tiếp tục nghiên cứu khả năng thủy phân của enzy me chitosanase từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 đối với các loại chitosan có độ deacetyl khác nhau.
- Đề tài mới bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ
thuật từ Streptomyces griseus VTCC - A - 1126, cần tiếp tục nghiên cứu tinh sạch
enzyme chitosanase.
-Tiếp tục nghiên cứu thêm khả năng sinh enzyme chitosanase ở các chủng
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ Thủy sản (2003), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nhà xuất bản
nông nghiệp.
2. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme protease từ B. subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Hữu Hiệp (2006), Giáo trình vi sinh vật chuyên sâu, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu, Nguyễn Thụy Dạ Thảo, Phan Anh Tú
(2004), “Nghiên cứu quy trình chiết tách và ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm
mật Coprinus Fimentarius”, Báo cáo tổng kết nghiệm thu sở Khoa học và Công nghệ, TP. Hồ Chí Minh.
6. Đặng Văn Hợp (2000), Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất protease từ Asperigillus oryzae A4 và ứng dụng vào sản xuất nước mắm, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
7. Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Chikafusa Fukazawa (1999), “Nghiên cứu tinh chế và xác định tính chất của chitinase từ đậu tương”, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội.
8. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2003), Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại học Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003), Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
10. Trần Thị Luyến (số 1 - 2003), “Nghiên cứu sản xuất chitosan bằng enzyme
11. Trần Thị Luyến (2004), “Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp Bộ sản
xuất chitin, chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản (vỏ tôm, vỏ ghẹ)”, Trường Đại học
Thủy sản Nha Trang.
12. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2006), Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
13. Trần Thị Luyến (số 3 - 2005), “Nghiên cứu khả năng làm giảm số lượng vi sinh vật
trên bề mặt thịt bò bao gói màng chitosan phối trộn phụ liệu”, Tạp chí Khoa học công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Thủy sản.
14. Trần Thị Luyến (số 1 - 2006), “Nghiên cứu sử dụng olygoglucosamin từ chitosan
vỏ tôm, vỏ ghẹ để thay thế NaNO3 trong bảo quản xúc xích gà surimi”, Tạp chí Khoa học công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Thủy sản.
15. Trần Thị Luyến (2007), “Nghiên cứu sản xuất COS từ chitin, chitosan bằng
enzyme”, Báo cáo khoa học đề tài cấp trường, Trường Đại học Nha Trang.
16. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội.
17. Đỗ Văn Ninh (2004), Nghiên cứu thủy phân protein cá bằng proteaza nội tạng cá, mực và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân, Luận án tiến sĩ
kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
18. Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), Nghiên cứu chiết suất protease từ đầu tôm bạc nghệ (Metapenaeus brevicornis) và ứng dụng thủy phân cơ thịt cá mối, Luận văn thạc sĩ kỹ
thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
19. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982),
Enzyme vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
20. Lê Thị Tưởng (2007), Nghiên cứu thủy phân chitin, chitosan bằng enzyme hemicellulase và ứng dụng sản phẩm thủy phân vào bảo quản sữa tươi nguyên liệu, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang.
21. Nguyễn Thị Xuyến (1996), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP.Hồ Chí
Minh.
TIẾNG ANH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
22. A. Loredo, R. Rodriguez-Herrera, J. C. Montanez, A. V. Charles-Rodríguez (2005), “Chitosan-oligosaccharides production by endo-chitosanase and their fungal
inhibition capacity in corn tortillas”, Nutraceutical & Functional Foods General I , Session 35.
23. Chih-Yu Cheng, Chu-Han Chang, Yue-Jin Wu, and Yaw-Kuen Li (2006),
“Exploration of Glycosyl Hydrolase Family 75, a Chitosanase from Aspergillus fumigatus”, J. Biol. Chem., Vol. 281, Issue 6, pp. 3137-3144.
24. Edward M. Marcotte, Arthur F. Monzingo, Stephen R. Ernst, Ryszard Brzezinski & Jon D. Robertas (1996), “X-ray structure of an anti-fungal chitosanase from
Streptomyces sp. N174”, Structural Biology 3, Department of Chemistry and Biochemistry University of Texas Austin, Texas 78712, USA.
25. Hong Kyoon No et al (2002), “Antibacterial activity of chitosans and chitosan olygomers with different molecular weights”, International Journal of Food Microbiology, Volume 74, Issues 1-2, pp. 65- 72.
26. Fukamizo T. (2000), “Chitinolytic enzymes: catalysis, substrate binding, and their application”, Current Protein Peptide Science 1, pp.24-105
27. Jae Kweon Park, Kumiko Shimono, Nobuhisa Ochiai, Kazutaka Shigeru, Masako Kurita, Yukari Ohta, Katsunori Tanaka, Hideyuki Matsuda, and Makoto Kawamukai (1999), Purification, Characterization, and Gene Analysis of a Chitosanase (ChoA) from Matsuebacter chitosanotabidus 3001, Department of Life Science and Biotechnology, Faculty of Life and Environmental Science, Shimane University, 1060 Nishikawatsu, Matsue, Shimane 690-8504, Japan.
28. Jon D. Robertus, The chitosanase from Streptomyces sp. N174, University of Texas at Austin.
29. Jun-ichi Saito, Akiko Kita, Yoshiki Higuchi, Yoshiho Nagata, Akikazu Ando, and Kunio Miki (1999), Crystal Structure of Chitosanase from Bacillus circulans MH-K1 at 1.6-Å Resolution and Its Substrate Recognition Mechanism, Department of Chemistry, Graduate School of Science, Kyoto University, Sakyo-ku, Kyoto 606- 8502, Japan and the Department of Biotechnology, Graduate School of Science and Technology, Chiba University, Matsudo-city, 271-8510, Japan, Vol. 274, Issue 43, pp. 30818-30825.
30. JY Masson, I Boucher, WA Neugebauer, D Ramotar and R Brzezinski (1995), “A new chitosanase gene from a Nocardioides sp. is a third member of glycosyl hydrolase family 46”, Microbiology, Vol 141, pp. 2629-2635.
31. Lian –Ying Zheng and Jiang – Feng Zhu (2003), Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weight, carbohydrates polymers, Volume 54, Issues1 december 2003, pp. 527 – 530.
32. Pozo, MJ; Azcon-Aguila, Dumas-Gaudot, Barea (1998), “Chitosanase and chitinase activities in tomato roots during interactions with arbuscular mycorrhizal fungi or Phytophthora parasitica”, Journal of Experimental Botany, Volume 49, Number 327, pp. 1729-1739.
33. R.A.A. Muzzarelli and M.G.Peter (1997), Chitin Handbook, eds European Chitin Society. TỪ TRANG WEB 34. http://jbc.org/cgi/content/abstract/249/3/811 35. http://jb.asm.org/cgi/content/abstract/178/17/5065 36. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm 37. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan02.htm 38. http://en.wikipedia.org/wiki/Glucosamine 39. http://pages.usherbrooke.ca/rbrzezinski/
PHẦN PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 3.1. Số lượng khuẩn lạc của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 trong các
môi trường có nguồn cacbon khác nhau
Nguồn cacbon Số lượng khuẩn lạc (CFU)
Glucose 167.109 Saccharose 120.109 Mannitol 30.1010 Tinh bột thô hòa tan 28.1010
Bảng 3.2. Khối lượng tế bào trong các môi trường có nguồn cacbon khác nhau Nguồn cacbon Khối lượng tế bào, g/100 ml
Glucose 0,94 Saccharose 0,6
Mannitol 1,5 Tinh bột thô hòa tan 1,4
Bảng 3.3. Số lượng khuẩn lạc của Streptomyces griseus VTCC - A - 1126 theo thời gian nuôi cấy
Thời gian, giờ Số lượng khuẩn lạc, CFU Lg (CFU)
2 122.104 6,08636 4 122.104 6,08636 6 104.105 7,01587 8 43.106 7,63146 22 89.1010 11,94939 24 25.1011 12,39794 26 27.1011 12,42488 28 75.1011 12,87506 30 97.1011 12,98677 42 97.1011 12,98767 46 118.1011 13,07188
48 20.1012 13,30103 52 172.1011 13,23553 54 140.1011 13,14613 66 95.1011 12,97772 68 91.1011 12,95904 72 94.1011 12,97313 74 94.1011 12,97313
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - chitosan - trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase của Streptomyces griseus
VTCC – A – 1126 Nồng độ chitosan, % Tổng hoạt độ, U/100ml dịch thể E Hàm lượng protein, mg/100ml Hoạt độ riêng U/mg protein 0,5% 260,690 2296,636 0,114 1,0% 405,517 3296,364 0,123 1,5% 389,425 3205,455 0,121 2,0% 274,770 2387,273 0,115 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.5. Hoạt độ chitosanase theo thời gian nuôi
Thời gian nuôi sinh
enzyme, ngày Tổng hoạt độ, U/100ml dịch thể E Hàm lượng protein, mg/100ml Hoạt độ riêng U/mg protein 01 102,069 1750,909 0,058 02 274,483 2387,273 0,115 03 415,862 3478,182 0,120 04 433,103 4296,364 0,101 05 398,621 4205,455 0,095
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của loại tác nhân kết tủa đến hoạt độ chitosanase Tác nhân kết tủa Tổng hoạt độ chitosanase,
U/g CPE
Aceton 29,483 Ethanol 24,310
Ammonium sulphate 21,724
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ (%) aceton đến hoạt độ CPE chitosanase Nồng độ aceton, % Tổng hoạt độ chitosanase, U/g CPE 60 3,621 65 11,379 70 29,483 75 35,948 80 28,190
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE chitosanase pH Tổng hoạt độ chitosanase, U/g CPE 3,5 30,82 4,0 37,25 4,5 39,67 5,0 48,52 5,5 34,03
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ CPE chitosanase Nhiệt độ, oC Tổng hoạt độ chitosanase,
U/g CPE 30 ± 1 41,25 35 ± 1 47,37 40 ± 1 55,28 45 ± 1 63,68 50 ± 1 45,17 55 ± 1 24,83 60 ± 1 14,76
Bảng 3.10. Sự giảm độ nhớt của dung dịch chitosan 1% theo thời gian thủy phân Thời gian, giờ Độ nhớt, mPa.s 0 2 6 8 16 20 24 Mẫu 1 142,15 13,63 5,48 4,37 2,07 1,62 1,58 Mẫu 2 142,15 9,34 3,63 3,43 1,50 1,40 1,37 Mẫu 3 142,15 8,09 3,34 2,89 1,45 1,38 1,31 Mẫu 4 142,15 7,17 2,82 2,69 1,30 1,25 1,17 Mẫu 5 142,15 6,34 2,79 2,65 1,28 1,20 1,18
PHỤ LỤC 2
2.1. PHƯƠNG PHÁP XÁC ỊNH Đ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME
CHITOSANASE [9], [16] 2.1.1. Nguyên tắc:
Hoạt tính của enzyme chitosanase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm glucosamine của quá trình phân giải chitosan. Một đơn vị hoạt tính được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1µg glucosamine trong thời
gian một phút ở nhiệt độ 30oC.
2.1.2. Cách tiến hành
- Chuẩn bị dung dịch chitosan 1%: hòa tan 1g chitosan trong 100ml dung dịch
acid acetic 0,5%; khuấy liên tục để chitosan tan hoàn toàn. Sau đó đem bảo quản lạnh
dung dịch chitosan 1%.
- Xác định hoạt tính enzyme chitosanase: Hỗn hợp phản ứng gồm 1ml dung
dịch chitosan 1% và 1ml enzyme. Giữ ở 30oC trong 20 phút. Phản ứng thủy phân được
ngừng lại bằng cách đun sôi trong 3 phút. Lượng glucosamine tạo thành sau phản ứng
thủy phân bởi enzyme chitosanase được xác định theo phương pháp Elson-Morgan.
2.1.3. Cách tính kết quả
Một đơn vị hoạt tính (đvht) của enzyme chitosanase tương đương với 1µg
glucosamin tạo thành trong thời gian thủy phân chitosan là 1 phút ở nhiệt độ phản ứng.
Trong đó: a - hàm lượng glucosamin (µg/ml) trong dung dịch thí nghiệm đã pha loãng
d - hệ số pha loãng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
V - thể tích enzyme ban đầu (ml)
v - thể tích enzyme thí nghiệm (ml)
t - thời gian phản ứng (phút)
m - khối lượng chế phẩm enzyme sử dụng Đvht/g CPE = a(µg/ml).d.V
2.2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG GLUCOSAMINE THEO ELSON-MORGAN [9], [16]
2.2.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự hình thành các dẫn xuất pyrrole khi glucosamine
được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrole này sẽ cho phản ứng màu với thuốc thử Ehrlich.
Đường amin hydrochlorid được đun nóng với acetyl aceton trong dung dịch
kiềm khoảng 1 giờ trước khi thêm thuốc thử Ehrlich. Những lượng tương đương
glucosamine cho ra những cường độ màu tương đương cùng điều kiện.
2.2.2. Pha chế thuốc thử
- Thuốc thử Ehrlich: 0,8 g p-dimethylaminobenzaldehyd (DMAB) pha trong 30 ml dung dịch HCl đậm đặc.
- Thuốc thử acetyl aceton: pha 2,5 ml acetyl aceton trong 50 ml dung dịch đệm
carbonat Na2CO3/NaHCO3 1 N, pH = 9,6.