Do tính chất không tan trong nước mà chitin ít được sử dụng trực tiếp. Nhưng từ nó trải qua nhiều giai đoạn xử lý hóa chất có thể điều chế dẫn xuất như glucosamine, chitosan …Thì nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
Chitosan có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau:
* Trong mỹ phẩm: Dùng làm phụ gia để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp sinh học với da, chống tia cực tím, làm mềm da, làm kem lột mặt…
* Trong công nghiệp: Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in, phim ảnh. Chitosan dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm.
* Trong xử lý nước thải: Chitosan dùng để xử lý nước thải trong công nghiệp (tạo phức với các kim loại nặng độc hại), để lọc trong nước sạch tiêu dùng.
* Trong nông nghiệp: Chitosan chống lại các vi nấm và vi khuẩn gây bệnh của môi trường xung quanh, để bảo vệ thực vật, còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa.
* Trong công nghiệp thực phẩm: Để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản thực phẩm, hoa quả, rau tươi…Vì nó tạo màng sinh học không độc. Người ta đã tạo màng chitosan trên quả tươi để bảo quản quả đào, quả lê, quả kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà chua, qủa vải, soài, nho…Dùng để lọc trong các loại nước quả ép, bia rượu vang, nước giải khát…
Là một polyme dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính sinh học đa dạng, chitosan được đưa vào thực phẩm, thức ăn, bánh kẹo, nước giải khát.
* Trong công nghệ sinh học: Dùng để cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc.
* Trong y tế: Đây là ứng dụng quan trọng nhất mang lại hiệu quả kinh tế cao của chitosan:
- Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng…
- Dùng làm chất màng sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polyme.
- Chitosan dùng làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết phỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: Hạ Lipid và cholesterol máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xưng khớp, viêm khớp, viêm xương, loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư.
- Dùng làm vật liệu: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép…
Người ta ít sử dụng chitin làm phụ gia thực phẩm vì chitin không hòa tan trong nước, các dung dịch acid loãng hay kiềm. Mặt khác, chitin có tác dụng kháng khuẩn yếu hơn chitosan, nó không có tác dụng kháng nấm như chitosan (chitosan có cấu trúc giống như các polyamin, đó là các polyme có tính kháng nấm đặc hiệu).
Tóm lại: Công nghệ nghệ sản xuất chitin-chitosan trên thế giới cũng như trong nước hiện nay hầu như chưa đề cập đến việc tận thu protein nên gây ra một sự lãng phí rất lớn nguồn protein từ phế liệu đầu tôm. Điều này cho thấy, việc sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hoá học làm giảm giá trị dinh dưỡng của thành phần protein. Chính vì vậy, hiện nay vấn đề áp dụng công nghệ
sinh học trong công nghệ sản xuất chitin-chitosan nhằm tận dụng nguồn protein
đồng thời nâng cao chất lượng của chitosan đã và đang thu hút sự quan tâm của
rất nhiều nhà khoa học. Một số nghiên cứu đã đi vào chứng minh tác dụng của
quá trình ủ xi lô với việc tăng chất lượng sản phẩm chitosan. Các nghiên cứu nói chung đều đạt được kết quả rất cao về khả năng thu hồi protein và chitin.
Thông qua các nghiên cứu có thể thấy rằng cho đến nay ở Việt Nam chưa có công trình nào công bố “Nghiên cứu kết hợp phương pháp ủ xi lô trong công nghệ sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu đầu vỏ tôm”. Chính vì vậy, trong luận văn này tiến hành nghiên cứu các nội dung cơ bản sau:
- Đánh giá các thành phần cơ bản của phế liệu tôm.
- Nghiên cứu phương pháp ủ xi lô kết hợp bổ sung acid ở nồng độ thấp trong việc khử protein, khoáng từ phế liệu tôm.
- Xác định thời gian, nồng độ HCl, acid lactic (C3H6O3) thích hợp khử khoáng còn lại.
- Đánh giá chất lượng dịch ủ.
- Đánh giá sơ bộ tác động môi trường nước thải của qui trình, so sánh với qui trình đang sử dụng phổ biến hiện nay.
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu đầu vỏ tôm
Trong số các loại tôm có thể thấy rằng ở nước ta tôm sú (Penaeus monodon) là loại có sản lượng cao nhất, được nuôi phổ biến ở Đồng bằng Sông Cửu Long, đặc biệt tại tỉnh Cà Mau. Thành phần phế liệu của tôm sú có hàm lượng chitin, protein cao. Vì vậy, trong đề tài này chọn đầu, vỏ tôm sú là đối tượng nghiên cứu (đầu 50%, vỏ 50%). Phế liệu tôm sú được thu nhận tại Công ty thủy hải sản Minh Phú, khu công nghiệp phường 8, tỉnh Cà Mau.
Hình 2. Nguyên liệu đầu vỏ tôm sú2.1.2. Dụng cụ, hóa chất 2.1.2. Dụng cụ, hóa chất
2.1.2.1. Dụng cụ
- Thiết bị ủ xi lô là các bọc nhựa có dung tích 2-10 kg được mua trên thị trường.
- Thau, khay nhựa để phơi mẫu khi thí nghiệm và lấy mẫu đem đi phân tích.
- Dụng cụ thủy tinh như: Ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, ống nhỏ giọt, cốc đốt, bình định mức, ống đong, pipet, buret, phễu thủy tinh, chai thủy tinh dung tích 12 ml để lấy mẫu thí nghiệm,…
- Máy móc và thiết bị: Cân phân tích, bếp điện, máy đo pH, tủ sấy, lò nung, máy đo độ hấp phụ quang học,..
2.1.2.2. Hóa chất sử dụng
- Đối với quá trình ủ xi lô, sử dụng một số hóa chất như: + Kali sorbate, cồn.
+ Acid: HCOOH, HCl (hóa chất thí nghiệm) + Muối hạt, rỉ đường.
- Đối với quá trình sản xuất chitin, chitosan sử dụng enzyme alcalase, HCl(đặc), NaOH.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp thu mẫu 2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Nguyên liệu đầu, vỏ tôm sú được thu nhận, yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất (tỷ lệ đầu 50%, vỏ 50%). Nguyên liệu trước khi sử dụng được loại bỏ tạp chất, để ráo nước, cấp đông block (-350C) vận chuyển về phòng thí nghiệm bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng.
2.2.2. Phương pháp phân tích
* Đánh giá cảm quan: Màu sắc, trạng thái, mùi… trong quá trình thí nghiệm và mẫu vật thu được
* Phương pháp phân tích:
- Xác định hàm lượng protein, khoáng, ẩm theo phương pháp của AOAC (1990) [21].
- Xác định độ deacetyl bằng phương pháp quang phổ Tan et al. (1998). - Xác định độ đục bằng máy đo HACH.
- Xác định độ nhớt được thực hiện trên nhớt kế Brookfield theo phương pháp Mukku, 2007.
- Xác định hàm lượng lipide thô bằng máy SOXHLET.
- Xác định thành phần và hàm lượng aicd amin bằng phương pháp sắc ký khí. - Xác định hàm lượng acid tổng theo TCVN 3702-90.
- Xác định hàm lượng astaxanthin bằng phương pháp quang phổ.
(Phương pháp phân tích chi tiết đính kèm phụ lục)
2.2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Phế liệu tôm
Xác định loại acid: HCOOH, HCl, HCOOH /HCl. Tỷ lệ acd/nguyên liệu
Bổ sung: Kali sorbat 0,2%, muối 1%, chitosan 0,1% Khử khoáng HCl 1%, 2%, 3%; thời gian 4, 8, 12 h Khử khoáng
acid lactic 1%, 2%, 3%; thời gian 4, 8, 12 h Deacetyl 70%NaOH T=8h, t0C=800C Chitin 2 Chitosan 1 Chitosan 2 Chitin 1 Deacetyl 70%NaOH T=8h, t0C=800C Ủ xi lô để khử protein, khoáng Tỷ lệ đường/nguyên liệu Ép Bã ủ (BCP) Dịch ủ Khử protein bằng enzyme alcalsae 0,2%, 550C, 6 h - Đánh giá chất lượng - Đề xuất biện pháp sử dụng Thời gian ủ
Thuyết minh: Nguyên liệu đầu vỏ tôm sau khi loại tạp chất, để ráo nước được trộn với acid, rỉ đường, các chất phòng thối, muối theo các tỷ lệ nghiên cứu và ủ xi lô. Từ đó chọn ra được chế độ ủ tối ưu:
- Sau khi có chế độ ủ tối ưu, bã ủ (BCP) khử protein tiếp bằng enzyme alcalase 0,2% (Theo Trang Sĩ Trung, đề tài báo cáo cấp Bộ năm 2008).
- Khử khoáng bằng 2 loại acid: HCl, acid lactic ở nồng độ 1%, 2%, 3%, thời gian 4, 8, 12. Tiếp đó đem đi phơi khô hoặc sấy thu được sản phẩm chitin, deacetyl bằng NaOH 70% thời gian 8 giờ, nhiệt độ 80 oC, đem rửa sạch và phơi khô thu được sản phẩm chitosan.
- Dịch ủ của quá trình ủ: Thu hồi bằng nén vít, đem đánh giá chất lượng và đề xuất biện pháp sử dụng.
2.2.4. Xác định loại acid, đường, thời gian ủ xi lô 2.2.4.1. Xác định loại acid thích hợp 2.2.4.1. Xác định loại acid thích hợp P hế liệu tôm Muối: 1% Rỉ đường: 6% P hối trộn Nước 50% Rửa trung tính (pH=7)
Xác định hàm lượng protein, khoáng, ẩm
Chọn loại acid thích hợp
Trong thí nghiệm này 3 loại acid là HCOOH, HCl, hỗn hợp HCOOH+HCl được lựa chọn để tiến hành ủ xi lô phế liệu tôm. Để tránh ảnh hưởng đến chất lượng protein và astaxanthin, pH của dung dịch được chọn không nên nhỏ hơn 4.
(đầu + vỏ)
Kali sorbat 0,2% Chitosan 0,1%
Ủ xi lô bằng các acid HCOOH, HCl, HCOOH+ HCl Thời gian 3 ngày, nhiệt độ phòng
Qua khảo sát tìm được tỷ lệ acid/phế liệu (v/w) như sau: HCOOH 0,5%, HCl 0,3%, HCOOH+HCl 0,1%+0,15%, pH của các mẫu phế liệu khi cho acid vào đảm bảo tương đương nhau.
- Trong quá trình ủ phải buộc chặt bọc, theo dõi sự dao động pH của từng tỷ lệ acid ở từng mẫu, khoảng 6-12 h tiến hành đo pH một lần.
- Bã tôm ủ xi lô sau khi phơi khô, lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu như độ ẩm, hàm lượng protein, hàm lượng khoáng.
2.2.4.2. Xác định tỷ lệ acid/phế liệu thích hợp
P hế liệu tôm
Muối: 1% Rỉ đường: 6% P hối trộn Nước 50% Xử lý HCOOH %/nguyên liệu
với các tỷ lệ khác nhau 0 0,5 1 1,5 2 Ủ xilô ( 3 ngày, tphòng) Rửa trung tính (pH=7)
Xác định hàm lượng protein, khoáng, ẩm
Chọn tỷ lệ acid thích hợp
- Trong đó, tỷ lệ acid formic là tỷ lệ phần trăm (%) thể tích so với khối lượng phế liệu (v/w). Với mẫu đối chứng (ĐC) không bổ sung acid, các mẫu khác lần lượt 0,5%v/w; 1%v/w; 1,5%v/w; 2%v/w.
- Trong quá trình ủ phải buộc chặt bọc, theo dõi sự dao động pH của từng tỷ lệ acid ở từng mẫu, khoảng 6-12 h tiến hành đo pH một lần.
(đầu + vỏ)
Kali sorbat kali 0,2% Chitosan 0,1%
- Bã tôm ủ xi lô sau khi phơi khô, lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu như độ ẩm, hàm lượng protein, hàm lượng khoáng.
2.2.4.3. Xác định tỷ lệ rỉ đường/phế liệu thích hợp
Xác định tỷ lệ rỉ đường/phế liệu bổ sung thích hợp cho quá trình khử protein, khoáng phế liệu tôm bằng phương pháp ủ xi lô được tiến hành như sau: Sau khi xác định được tỷ lệ acid và loại acid thích hợp và cố định, tiếp tục bổ sung rỉ đường vào phế liệu tôm theo các tỷ lệ 2%; 4%; 6%; 8%; 10%; 12%; 14%. Tiến hành quá trình ủ trong 3 ngày, khoảng 6-12 giờ đo pH một lần. Mẫu thí nghiệm được rửa trung tính, đem phơi khô, bảo quản nơi thoáng mát và xác định hàm lượng protein, khoáng, ẩm còn lại trong bã tôm.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.4.4. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình ủ xi lô
Trộn tỷ lệ acid và đường bổ sung vào phế liệu tôm đã xác định ở trên. Tiến hành quá trình ủ trong các khoảng thời gian khác nhau: 2, 3, 4, 5, 6 ngày. Mẫu thí nghiệm được rửa trung tính, đem phơi khô, bảo quản nơi thoáng mát và xác định hàm lượng protein, khoáng, ẩm còn lại trong bã tôm.
Phế liệu tôm
Khử protein, khoáng bằng phương pháp ủ xilô ở nhiệt độ phòng, thời gian 3 ngày, với tỷ lệ acid xác định,
với tỷ lệ đường % khác nhau
Xác định hàm lượng protein, khoáng
4 6 8 Chọn tỷ lệ rỉ đường thích hợp 10 2 Ép 12 14
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.4.5. Xác định điều kiện tối ưu cho công đoạn ủ xi lô
Qua khảo sát trên ta tìm ra được các khoảng điều kiện thích hợp như tỷ lệ acid, tỷ lệ rỉ đường, thời gian cho quá trình ủ xi lô. Tuy nhiên khả năng khử protein, khoáng, chất lượng dịch ủ còn chịu ảnh hưởng khi 1 trong 3 nhân tố trên thay đổi. Do đó ta cần bố trí thí nghiệm tìm giá trị tối ưu.
Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình Box–Benhkan (Box and Behnken, 1960) [23]
Phế liệu tôm
Khử protein, khoáng bằng phương pháp ủ xilô ở nhiệt độ phòng, với tỷ lệ acid, rỉ đường xác định, với thời gian khác nhau (ngày)
Xác định hàm lượng protein, khoáng
tôm 3 4 5 Chọn thời gian thích hợp 6 2 Ép
Bảng 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tối ưu acid, rỉ đường, thời gian Nhân tố Mức Nhân tố Mức Tỷ lệ HCOOH (%) A1 A2 A3 Tỷ lệ rỉ đường sử dụng (%) D8 D10 D12 Thời gian (ngày) T2 T3 T4 Số nghiệm thức Tỷ lệ HCOOH (%) Tỷ lệ rỉ đường (%) Thời gian (ngày) Ký hiệu mẫu 1 2 10 3 A2D10T3 2 3 10 2 A3D10T2 3 3 10 4 A3D10T4 4 2 8 2 A2D8T4 5 1 8 3 A1D8T2 6 1 10 4 A1D10T4 7 2 12 2 A2D12T2 8 2 10 3 A2D10T3 9 3 8 3 A3D8T3 10 1 10 2 A1D10T2 11 3 12 3 A3D12T3 12 1 12 3 A1D12T3 13 2 12 4 A2D12T4 14 1 10 3 A1D10T3 15 2 8 4 A2D8T4
- Trong quá trình ủ phải buộc chặt bọc, theo dõi sự dao động pH của từng mẫu, khoảng 6-12 h tiến hành đo pH một lần.
- Bã tôm ủ xi lô sau khi phơi khô, lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu như: Độ ẩm, hàm lượng protein, hàm lượng khoáng => Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm theo mô hình Box – Benkan và kết quả phân tích 15 mẫu kiểm, ta xác định được giá trị tối ưu bằng đồ thị mặt đáp ứng bằng phần mền NEMRODW.
2.2.5. Xác định nồng độ acid khử khoáng
Bán chế phẩm sau khi khử protein bằng enzyme alcalase 0,2%, đem rửa sạch. Tiếp tục khử khoáng bằng 2 loại acid HCl, acid lactic với cùng nồng độ 1%, 2%, 3% (w/v 1/5), thời gian khử 4, 8, 12 h.
Mẫu thí nghiệm được rửa trung tính, đem phơi xác định hàm lượng khoáng còn lại. Chọn nồng độ và thời gian thích hợp khử khoáng
* Dịch ủ : Đánh giá - đề xuất sử dụng.
* Tiếp tục lấy chitin 1, chitin 2 sản xuất chitosan.
Sơ đồ thí nghiệm (*): Chitin 1, 2 (ướt) Ngâm NaOH Rửa trung tính (pH=7) Phơi khô Chitosan 1, 2
(*)TS. Trang Sĩ Trung, 2008, Báo cáo đề tài cấp Bộ, Trường Đại Học Nha
Trang.
Đánh giá chất lượng Chitosan 1, 2
2.2.6. Đánh giá nước thải
Nước thải lấy từ qui trình khử khoáng bằng HCl, do mức độ tác động môi trường của HCl cao hơn acid lactic, thu hồi nước thải bằng cách: Từ khâu rửa bã của công đoạn ủ xi lô sau khi tách dịch ủ đến sản phẩm chitin với thể tích 1,8 lít. Yêu cầu nước rữa của các công đoạn phải đồng nhất, thời gian giữa các công đoạn nước thải phải được bảo quản đông lạnh tránh khả năng biến tính ảnh
NaOH 70% tỷ lệ w/v: 1/5
hưởng đến kết quả kiểm nghiệm. Xác định các chỉ tiêu môi trường và so sánh với phương pháp hóa học.
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU
* Hiệu suất khử protein, khoáng (%) được xác định dựa trên công thức
của Rao và cộng sự (2000)[21] như sau:
- Hiệu suất khử protein: (%)DP = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O)
Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý.
- Hiệu suất khử khoáng: (%)DA = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O)
Trong đó: