1.6.1. Cơ sở lý thuyết [3]
Ưu điểm
- Làm giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết, do đó sẽ làm giảm thời gian tiến hành thí nghiệm và chi phí vật chất.
- Nhận được mô hình toán học thực nghiệm do đó đánh giá được vai trò của các tác động qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu.
- Cho phép xác định điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu, một cách khá chính xác bằng các công cụ toán học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục bộ như ở các thí nghiệm theo phương pháp cổ điển.
- Sử dụng thiết kế Behnken-Box trong thống kê để bố trí thí nghiệm tối ưu hóa. Thiết kế Behnken-Box là thiết kế thử nghiệm cho phương pháp bề mặt phản
ứng, được nghĩ ra bởi George EP Box và Donald Behnken vào năm 1960, nhằm đạt được các mục tiêu sau đây:
+ Mỗi yếu tố, hoặc biến độc lập, được đặt tại một trong ba giá trị cách đều nhau. (Ít nhất ba cấp độ là cần thiết cho mục tiêu tiếp theo).
+ Thiết kế nên vừa đủ để phù hợp với một mô hình bậc hai, đó là có chứa các giới hạn bình phương và các sản phẩm của hai yếu tố.
+ Tỷ lệ của số lượng các điểm thử nghiệm với số lượng các hệ số trong mô hình bậc hai nên hợp lý (trên thực tế, các thiết kế thường giữ nó trong khoảng từ 1,5 đến 2,6).
+ Phương sai ước tính nên nhiều hoặc ít, chỉ phụ thuộc vào khoảng cách từ trung tâm ( điều này đạt được sự chính xác cho các thiết kế với 4 và 7 yếu tố), không nên thay đổi quá nhiều bên trong khối lập phương nhỏ nhất chứa các điểm thử nghiệm.
+ Thiết kế với 7 yếu tố được tìm thấy đầu tiên trong khi tìm kiếm một thiết kế tài sản mong muốn liên quan đến phương sai ước lượng, và sau đó các thiết kế tương tự đã được tìm ra cho số các yếu tố khác.
+ Mỗi thiết kế có thể được xem như là một sự kết hợp của một thiết kế giai thừa bậc hai (đầy đủ hoặc phân đoạn) với một thiết kế khối không đầy đủ. Trong mỗi khối, một số lượng nhất định các yếu tố được đặt thông qua tất cả các kết hợp cho thiết kế giai thừa, trong khi các yếu tố khác được giữ ở các giá trị trung tâm. + Thiết kế cho 8 yếu tố không có trong giấy tờ gốc. Thiết kế cho số lượng các yếu tố khác cũng đã được phát minh ra (ít nhất lên đến 21). Một thiết kế cho 16 yếu tố tồn tại chỉ có 256 điểm giai thừa. Hầu hết những thiết kế này có thể được chia thành các nhóm (các khối), mỗi mô hình sẽ có một giới hạn hằng số khác nhau, nói một cách khác là các hằng số khối sẽ không tương quan với các hệ số khác [15].
1.6.2. Các bước tiến hành [10]
Yếu tố đầu vào Yếu tố đầu ra (Biến tiên đoán) (Hàm mục tiêu) (Yếu tố ảnh hưởng) (Biến đáp ứng)
X Y
- Phải chọn hàm mục tiêu. - Chọn biến tiên đoán.
Phân tích từ các biến tiên đoán để chọn ra các yếu tố ảnh hưởng chính, loại bỏ những yếu tố không cần thiết nhằm đảm bảo tính khả thi và tính hiệu quả của thực nghiệm. Những biến tiên đoán này phải điều khiển, kiểm tra, khống chế, kiểm soát được nó.
Bước 2: Xác định miền thí nghiệm
Miền thí nghiệm là khu vực trong đó các nhân tố biến thiên hay nói cách khác đó là miền mà chúng ta tiến hành thí nghiệm.
Để xác định miền thí nghiệm có 3 cơ sở: + Dựa vào lý thuyết
+ Tham khảo các công trình nghiên cứu đã công bố + Làm thí nghiệm thăm dò
Bước 3: Bố trí thí nghiệm
(Phương pháp thực nghiệm theo mô hình Box - Behnken)
*Lập ma trận thí nghiệm N U1 U2 ... Y 1 2 3 ... ...
Bước 4: Chuyển biến thực qua biến mã
Diễn biến quá trình (Hộp đen)
(U0: là giá trị trung bình) U U U X 0 , X1,1. *Lập ma trận biến mã N X1 X2 ... Y 1 2 3 ... ... Bước 5: Kiểm định hệ số và phương trình
Bước 6: Tối ưu hóa
1.7. Phân tích dữ liệu
Xử lý số liệu bất thường bằng Dulcan. Phân tích thống kê, ANOVA trong khảo sát điều kiện chiết bằng phần mềm MS. Excell. Thiết kế thí nghiệm tối ưu và tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert version 8.0 trial.
-1 1 Umin U0 Umax U U (biến thực) X (biến mã)
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
- Vỏ bưởi Năm Roi thu mua ngoài chợ.
2.1.2. Hóa chất
- Acid HClđđ, HNO3đđ, H2SO4đđ, CH3COOHđđ. - Cồn 960. - H2SO4 0,6 M. - Ammonium Molybdate 4 mM. - Sodium phosphate 28 mM. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu - Bình tam giác 250ml. - Cốc thủy tinh 250ml. - Pipet 10ml. - Pipetman 100µ, Pipetman 1000µ. - Ống đong 100ml. - Bể ổn nhiệt. - Tủ sấy.
- Máy đo UV-Vis
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xuất
Sử dụng phương pháp ngâm chiết để tách chiết pectin trong vỏ- cùi bưởi. Nguyên liệu được ngâm trong dung môi với một tỉ lệ xác định và ở một nhiệt độ , thời gian xác định sao cho quá trình chiết xuất là tối ưu.
2.2.2. Phương pháp định lượng
Định lượng pectin bằng phương pháp cân. Dịch chiết sau khi thu được sẽ cho kết tủa bằng cồn 960. Sau đó lọc lấy tủa và đem đi sấy đến khối lượng không đổi thu được trọng lượng tủa pectin thô. Để tính được phần trăm pectin trong nguyên liệu, lấy trọng lượng tủa pectin thô chia cho khối lượng mẫu.
Cách tính kết quả
Phần trăm pectin (P)(w/w) trong nguyên liệu được tính theo công thức: P= B/m* 100
Trong đó: B: Trọng lượng pectin thô tủa được. m: trọng lượng mẫu (g).
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa [18]
Chống oxy hóa tổng (TA) được xác định theo phương pháp của Prieto (1999), lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước cất và thêm 3 ml dung dịch A (H2SO4 0,6 M, sodium phosphate 28 mM and ammonium Molybdate 4 mM). Hỗn hợp được giữ 90 phút ở 950C. Sau đó đo ở bước sóng 695 nm với chất chuẩn là acid ascorbic.
Cách pha đường chuẩn là pha dung dịch acid ascorbic 1mg/1ml sau đó lấy 30µl, 50µl, 80µl, 100µl rồi bổ sung nước cất tương ứng cho đủ 1ml sau đó thêm 3ml dd A vào và giữ 90 phút ở 950C. Sau đó đo ở bước sóng 695nm. Với kết quả đo được thì vẽ đường chuẩn đưa ra phương trình. So sánh kết quả mẫu chiết với đường chuẩn thì có hoạt tính tương ứng mg acid ascorbic.
2.2.4. Phương pháp xác định hàm ẩm
Xác định hàm ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
Nguyên tắc: dung sức nóng làm bay hết hơi nước trong nguyên liệu (mẫu), cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy. Trọng lượng mẫu mất đi khi sấy khô tuyệt đối là lượng nước có trong mẫu. Từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu. Tiến hành: sấy cốc trong tủ sấy ở nhiệt đọ 1050C đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích xác định trọng lượng cốc cân m0(g). Cho 2g nguyên liệu vào cốc sấy, đem đi cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu là m1(g).
Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 1050C, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy.
Tiếp tục sấy cốc mẫu trong khoảng 2 giờ, thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không đổi. Ghi nhận khối lượng m2(g).
Kết quả tính độ ẩm (W)
W = (m1 - m2)*100/ (m1 – m0) (%)
Trong đó:
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi. m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy.
m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.
2.2.5. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu dữ liệu
Sử dụng phương pháp thống kê dùng trong sinh học, sử dụng phần mềm Microsoft excel 2007. Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert version 8 trial. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần (n=3).
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Quy trình chiết pectin dự kiến
Sơ đồ 2.1. Quy trình tách chiết pectin dự kiến
Dung dịch acid loãng
Nguyên liệu Xay nhỏ Thủy phân Kết tủa Sấy Pectin thô Rửa Lọc Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Từ quy trình dự kiến sẽ nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết pectin như: loại dung môi chiết, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu, thời gian chiết, nhiệt độ chiết, pH môi trường chiết và tiến hành tối ưu hóa điều kiện chiết.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp
Sơ đố 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Cho lần lượt vào 4 mẫu nguyên liệu các acid HCl, HNO3, H2SO4, CH3COOH với tỉ lệ dung môi trên nguyên liệu là 9/1
- Điều chỉnh pH về giá trị 4. - Nhiệt độ chiết là 900C. - Thời gian chiết là 90 phút.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi : nguyên liệu chiết
Sơ đồ 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ chiết thích hợp
Chiết
H2SO4 HCl HNO3 CH3COOH
Hàm lượng pectin
Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Chiết
3/1 6/1 9/1 12/1 15/1
Hàm lượng pectin
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Cho dung môi là acid thích hợp được xác định ở trên vào 5 mẫu nguyên liệu lần lượt với những tỷ lệ dung môi/nguyên liệu như sau: 3/1,6/1, 9/1, 12/1, 15/1. - Điều chỉnh pH về giá trị 4.
- Nhiệt độ chiết là 900C. - Thời gian chiết là 90 phút.
2.3.4. Bố trí thí nghiệm để xác định pH thích hợp
Sơ đồ 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định pH môi trường chiết thích hợp
Tiến hành chiết ở các điều kiện:
Điều chỉnh pH mẫu thí nghiệm về các giá trị pH=2; pH=4; pH=6; pH=8 bằng loại acid được xác định trên với tỷ lệ đã xác định.
Thời gian chiết là 90 phút Nhiệt độ chiết là 900C
2.3.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp
Tiến hành chiết ở các điều kiện như sau:
- Thời gian chiết lần lượt là 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút. - Nhiệt độ chiết là 900C
- Tỷ lệ DM:NL, pH, loại acid điều chỉnh pH được chọn theo kết quả nghiên cứu ở trên.
Chiết
pH:2 pH:4 pH:6 pH:8
Hàm lượng pectin
Sơ đồ 2.5. bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết thích hợp
2.3.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp
Sơ đồ 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết thích hợp
Tiến hành chiết ở điều kiện như sau:
- Mẫu được chiết ở những nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C, 700C,800C, 900C, 1000C.
- pH, thời gian chiết, tỷ lệ DM:NL, loại acid điều chỉnh pH được chọn theo kết quả nghiên cứu trên.
Chiết
30 phút 60 phút 90 phút 120 phút 150 phút
Hàm lượng pectin
Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Chiết
400C 500C 600C 700C 800C 900C 1000
C
Hàm lượng pectin
2.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa
Bảng 2.1. Bảng quy đổi biến mã và biến thực Mức biến mã Yếu tố đầu vào
-1 0 1
pH dung môi chiết (X1)
Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu (v/w) (X2) Thời gian chiết (phút) (X3)
3 2 70 4 3,5 90 5 5 110
Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực bằng mô hình Box- behnken Stt U1 U2 U3 X1 X2 X3 Y1 Y2 1 -1 -1 0 3 2 90 2 1 -1 0 5 2 90 3 -1 1 0 3 5 90 4 1 1 0 5 5 90 5 -1 0 -1 3 3,5 70 6 1 0 -1 5 3,5 70 7 -1 0 1 3 3,5 110 8 1 0 1 5 3,5 110 9 0 -1 -1 4 2 70 10 0 1 -1 4 5 70 11 0 -1 1 4 2 110 12 0 1 1 4 5 110 13 0 0 0 4 3,5 90 14 0 0 0 4 3,5 90 15 0 0 0 4 3,5 90 Trong đó:
Hàm mục tiêu Y1: hàm lượng pectin thô (g/100g NL)
Hàm mục tiêu Y2: hoạt tính chống oxy hóa tổng: g acid ascorbic/ 100g NL
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát một số yếu tố đầu vào tới hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa tổng oxy hóa tổng
3.1.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết lên hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa chống oxy hóa
Khảo sát 4 loại acid HCl, H2SO4, HNO3, CH3COOH trong những điều kiện chiết giống nhau: với 15g mẫu (nguyên liệu). Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 9/1, trong thời gian 90 phút, pH = 4 và nhiệt độ 900C, kết quả thu được sau:
Đồ thị 2: ảnh hưởng của loại acid đến hoạt tính chống oxy hóa của pectin
Nhìn vào đồ thị 1 và đồ thị 2 thấy: Hàm lượng pectin thô thu được và hoạt tính chống oxy hóa của pectin đạt cao nhất khi sử dụng H2SO4, ứng với hàm lượng pectin đạt 4,13g và hoạt tính chống oxy hóa tổng đạt 4,12g acid ascorbic.
Điều này được giải thích như sau: Đối với vỏ-cùi bưởi mềm dai, cần loại dung môi có độ acid đủ mạnh để phá vỡ cấu trúc tế bào nhanh chóng, hiệu quả, giải phóng pectin từ protopectin một cách triệt để nhất. Do đó khi sử dụng H2SO4 tách chiết được nhiều pectin thô hơn và hoạt tính chống oxy hóa của pectin đạt giá trị cao hơn khi sử dụng các loại acid khác.
Đồ thị 3: Sự tương quan giữa hàm lượng pectin thô và hoạt tính chống oxy hóa tổng
Nhìn vào đồ thị 3 cho thấy khi hàm lượng pectin tăng thì hoạt tính cũng tăng. Khi sử dụng HNO3 để chiết, hàm lượng pectin thấp nhất ứng với 3,885g/ 100g NL, hoạt tính tương đương 2,701g acid ascorbic. Khi chiết bằng H2SO4, hàm lượng pectin đạt 4,13g/ 100g NL, hoạt tính chống oxy hóa tổng đạt 4,12g acid ascorbic. Phân tích số liệu thấy hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa biến thiên theo hàm bậc 1: y= -0,081x + 4,202 với R2= 0,99.
Do vậy dung môi được chọn để chiết pectin chống oxy hóa từ vỏ bưởi Citrus sp. là acid H2SO4.
3.1.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ DM:NL lên hàm lượng pectin và hoạt tính chống oxy hóa hóa
Tại công đoạn nghiên cứu này, các yếu tố khác được cố định như: thời gian 90 phút, nhiệt độ 900C, pH = 4, dung môi là acid H2SO4; yếu tố tỷ lệ DM:NL được khảo sát trong dải 3/1 đến 15/1 với bước nhảy 3.
Kết quả cho thấy hàm lượng pectin giảm khi tăng tỉ lệ DM:NL. Ở tỉ lệ DM:NL là 3/1, hàm lượng pectin đạt cao nhất với 4,8g/ 100g NL. Ở tỉ lệ DM:NL là 15/1, hàm lượng pectin đạt thấp nhất ứng với 4,01g/ 100g NL. Giá trị trung bình của hàm lượng pectin đạt 4,26 ± 0,319g / 100g NL. Đồ thị 4 sau đây sẽ thể hiện chi tiết những phân tích trên.
Đồ thị 4. Ảnh hưởng của tỉ lệ DM:NL đến hàm lượng pectin thu được
Hàm lượng pectin chịu ảnh hưởng bởi tỷ lệ DM:NL theo phương trình phi tuyến bậc 2 có độ tương quan mạnh với xu hướng tiệm cận trục x
Y= 0,008x2 – 0,204x + 5,302 với R2 = 0,966
Điều này có thể giải thích rằng: ở tỷ lệ DM:NL vừa đủ sẽ giải phóng được hàm lượng pectin cao, ngược lại khi tỷ lệ DM:NL vượt ngưỡng sẽ tạo ra nồng độ cơ chất loãng, khả năng dung môi acid tiếp cận với các gốc và các vị trí liên kết yếu trong pectin dễ dàng hơn, điều này sẽ tạo ra sự phá hủy pectin thành các polysaccharide mạch ngắn hoặc chuyển hóa ngay thành dạng đường đơn hoặc đường đôi.
Đồ thị 5. Ảnh hưởng của tỉ lệ DM:NL đến hoạt tính chống oxy hóa
Phân tích đồ thị 5 thấy: hoạt tính chống oxy hóa của pectin có những biến đổi khác nhau qua những tỉ lệ chiết khác nhau, nhưng hoạt tính chống oxy hóa tổng trong miền khảo sát lại đạt cực đại ở tỉ lệ DM:NL = 15/1 ứng với 4,506g acid