FUCOIDAN TỪ LOÀI RONG S. POLYCYSTUM
Hiện có nhiều phương pháp thu nhận fucoidan từ rong nâu. Tuy vậy mỗi phương pháp đều có những hạn chế nhất định. Để có thể có một quy trình thu nhận fucoidan phù hợp với rong S. polycystum, tôi tiến hành nghiên cứu xác
định một số thông số tối ưu cho quá trình thu nhận fucoidan từ loài rong S. polycystum như sau :
Xác định điều kiện chiết rút fucoidan ra khỏi nguyên liệu rong S. polycystum :
Tiến hành 4 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 50 g rong S. polycystum để nghiên cứu thu nhận fucoidan bằng một số phương pháp chiết khác nhau : mẫu 1 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong dung dịch CaCl2 có gia nhiệt ở nhiệt độ 900C, mẫu 1 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường nước nóng, mẫu 3 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường axit HCl pH =2 ở nhiệt độ 1000C, mẫu 4 chiết rút fucoidan ra khỏi rong nâu trong môi trường axit HCl 0.1N ở nhiệt độ thường. Kết quả đánh giá quá trình thu nhận thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá quá trình chiết fucoidan từ rong nâu S. polycystum
STT Mẫu thí
nghiệm Trạng thái dung dịch
Hàm lượng fucoidan (% so với trọng lượng rong khô) 1 1 Dịch chiết thu được trong 2.07
2 2 Dịch chiết trong 3.54
3 3 Dịch ở trạng thái lỏng, trong 2.48 4 4 Dịch chiết thu được sánh 1.85
Nhận xét
Từ kết quả đánh giá quá trình chiết fucoidan từ rong nâu S. polycystum
thể hiện trong bảng 3.4, cho thấy mẫu 1 chiết rút fucoidan trong môi trường trong dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ 900C thì dịch chiết thu được sẽ trong và dễ lọc, dễ làm sạch, dịch chiết chỉ có chứa polysaccharide là fucoidan và laminaran. Tuy nhiên alginate bị kết tủa trong màng tế bào làm cho fucoidan không tan hết ra dịch chiết gây tổn thất một lượng fucoidan nên hàm lượng fucoidan thu được thấp, chỉ đạt 2.07 % so với trong lượng rong khô.
Mẫu 2 – chiết rút fucoidan trong môi trường nước nóng cho kết quả hàm lượng fucoidan thu được cao nhất và hàm lượng fucoidan thu được đạt tới 3.54 % so với khối lượng rong khô.
Mẫu 3 - ngâm chiết fucoidan trong môi trường axit loãng có gia nhiệt thì hàm lượng fucoidan thu được cũng không cao, chỉ đạt 2.48% so với khối lượng rong khô. Nguyên nhân là do tổn thất một lượng fucoidan trong quá trình gia nhiệt. Ở pH = 2, alginate sẽ tủa, tủa alginate trong tế bào thì sẽ gây cản trở quá trình trích li fucoidan, làm tổn thất một lượng fucoidan trong bã rong.
Mẫu 4 sử dụng axit loãng không gia nhiệt để chiết rút fucoidan thì dịch chiết sánh, rất khó lọc sạch và hàm lượng fucoidan thu được cũng rất thấp, chỉ đạt 1.85% so với khối lượng rong khô.
Từ những nhận xét ở trên, cho thấy quá trình tách chiết fucoidan đạt hiệu suất cao nhất khi sử dụng phương pháp chiết rút fucoidan trong môi trường nước nóng. Tuy nhiên khi tiến hành sản xuất fucoidan thì nguồn nguyên liệu đi từ rong chứ không phải bột rong. Rong có cấu trúc dai và chắc nên quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào rong để giải phóng fucoidan rất khó khăn. Do đó, trong công nghiệp sản xuất fucoidan ta có thể bổ sung kiềm vào trong nước xay trước khi gia nhiệt. Mục đích của việc này là làm mềm cấu trúc của tế bào rong biển, tạo thuận lợi cho việc giải phóng fucoidan.
Nghiên cứu tách alginic acid
Để tách alginic acid ra khỏi dịch rong nhằm tinh sạch fucoidan dùng ion Ca2+ để tủa alginic acid trong dịch rong. Nếu sử dụng CaCl2 để tach alginic acid thì cần loại ion Ca2+ dư ra khỏi dịch rong trước khi tủa fucoidan, vì ion Ca2+ dư gây rửa giải tủa fucoidan, đồng nghĩa làm tổn thất một lượng fucoidan.
Có hai phương pháp để loại ion Ca2+ là :
Dùng nhựa trao đổi ion dương để hấp phụ với các ion dương và giữ chúng trên hạt nhựa trao đổi.
Cho dung dịch rong chạy qua máy lọc rây phân tử MWCO 1kDa. Cho dịch rong chạy qua thiết bị lọc rây phân tử thì thời gian lâu, dẫn đến hiệu suất thu hồi fucoidan cũng không cao. Nên cách cho hiệu quả cao nhất là sử dụng nhựa trao đổi để hấp phụ các ion dương do muối điện li. Hơn nữa nhựa trao đổi có thể sử dụng lại bằng cách rửa giải hấp phụ bằng dung dịch axit.
Nghiên cứu tách laminaral
Tách fucoidan trên cột dùng nhựa anionit ví dụ IRA-480, CETAVLON, CETYLPYRIDIUM, HYAMIN ... Lamiraral sẽ theo dịch chảy ra ngoài. Sau khi tách fucoidan ra, ta thu nó bằng cách rửa giải bằng dung dịch muối. Để thu tủa fucoidan ta dùng EtOH làm dung môi tủa.
Dịch chiết sau khi tách alginat cho chạy qua cột nhựa trung tính (nhựa trung tính ví dụ polytefflon), laminaran được cho hấp phụ trên cột, laminaran sẽ bị giữ lại và trong dịch chỉ còn fucoidan. Dùng EtOH để tủa fucoidan trong dịch.
Tủa fucoidan ở nồng độ EtOH thích hợp. Ở nồng độ EtOH chiếm 70% thì fucoidan tủa, lên đến 85% thì laminaral tủa. Vì vậy, để thu được fucoidan thì nồng độ EtOH sử dụng để tủa là 70%.
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá quá trình tách laminaral Đặc điểm Phương pháp Chất tách được Chất còn lại trong dịch Nhận xét
Dùng nhựa anion Fucoidan Laminaral Phức tạp, chi phí lớn
Dùng nhựa trung tính Laminaral Fucoidan Chi phí lớn Tủa fucoidan ở EtOH
70% Fucoidan Laminaral
Đơn giản, dễ tiến hành
Từ kết quả đánh giá quá trình tách laminaral trong bảng 3.5, cho thấy phương pháp tủa fucoidan ở nồng độ 70% là phương pháp đơn giản và tốn ít chi phí nhất. Chính vì vậy, trong quá trình sản xuất fucoidan thì phương pháp này là phương pháp tối ưu để thu fucoidan tinh sạch.
Từ những các nghiên cứu ở trên và trên cơ sở một số nghiên cứu của các đồng sự của tôi đáng nghiên cứu về fucoidan, tôi đề nghị sử dụng quy trình sau đây để thu nhận fucoidan từ loài rong S. polycystum:
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình chiết xuất fucoidan cho hiệu suất chiết cao từ loài rong S. polycystum
Thuyết minh quy trình
Xử lí sơ bộ
Rong biển loài S. polycystum được đem rửa vài lần trong nước máy. Trong quá trình rửa loại bỏ tạp chất như cát, sạn, san hô chết… và các loại rong tạp. S. polycystum Bã Rong/nước = 1/8 NaOH/rong= 1/20 H2O2/rong= 1/40 = 45’ CaCl2/bột rong = 1/10 70% EtOH 900 Xử lí sơ bộ Thu fucoidan Tủa fucoidan
Lọc nhựa trao đổi ion dương Lọc cột cát và than hoạt tính 2 lần
Dịch Li tâm tách bã
Tủa Alginate Xay
Rong S. polycystum sau khi rửa được cho vào ngâm trong nước máy trong thời gian 1 giờ. Sau đó, ta đổ lượng nước ngâm này đi. Mục đích của quá trình ngâm này là làm hòa tan muối biển vào trong nước ngâm. Hàm lượng muối cao sẽ gây cản trở và làm hòa tan trở lại tủa fucoidan.
Sau khi ngâm rong 1 giờ trong nước máy, ta tiếp tục thêm nước với tỉ lệ rong/ nước là 1/8; đồng thời bổ sung thêm dung dịch NaOH 30% với tỉ lệ NaOH/rong là 1/20. Bổ sung NaOH vào trong lúc ngâm rong với mục đích làm mềm rong, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xay. Đồng thời, kiềm còn có tác dụng phá vỡ cấu trúc tế bào rong biển, tạo thuận lợi cho việc giải phóng các chất cần thiết.
Xay
Nâng nhiệt độ của hỗn hợp rong và nước lên 700C trước khi tiến hành xay. Vì ở nhiệt độ trên 700C thì các polysaccharide mới có thể giải phóng triệt để.
Xay rong bằng máy xay có lưỡi dao cắt chuyển động xoay quanh trục cố định. Thời gian xay là 45 phút. Trong 45 phút xay rong, ta bổ sung dung dịch H2O2 với tỉ lệ H2O2/rong là 1/40.
Tủa alginate
Trong quá trình xay ta cũng đồng thời tủa alginate. Vì alginate kết tủa với canxi trong điều kiện trung tính, nên ta cần trung hòa hỗn hợp rong xay trước khi cho CaCl2 với tỉ lệ CaCl2/rong là 1/10 vào thùng xay.
Li tâm tách bã
Hỗn hợp rong sau khi xay được đem li tâm để thu phần dịch, tách bỏ bã.
Lọc cát và than hoạt tính
Dịch rong sau khi lọc vải được lọc qua cột cát và than hoạt tính hai lần. Quá trình lọc này giúp loại bỏ các tủa alginate mịn và các chất rắn nhỏ lơ lửng
trong dịch. Sau khi lọc một thời gian, cột cát và than hoạt tính bị tắt nghẽn; ta cần phải rửa sạch cát và than hoạt tính trước khi tiến hành lọc tiếp.
Lọc nhựa trao đổi ion dương
Dịch rong được lọc qua cột nhựa trao đổi ion dương để loại bỏ muối trong dung dịch. Do các hạt nhựa trao đổi ion dương có chứa các gốc âm, có khả năng liên kết với các ion dương như Ca2+ do muối điện li, nên giữ chúng trên bề mặt hạt nhựa.
Tủa fucoidan
Sau đó dịch rong được tủa bằng EtOH 900 để thu fucoidan với nồng độ EtOH sử dụng chiếm 70%.
Thu tủa
Để một thời gian cho kết tủa lắng xuống hết, gạn bỏ lớp cồn phía trên. Sau khi tủa cồn xong thì tiến hành thu fucoidan bằng cách cho tủa qua thiết bị lọc hút chân không để loại cồn còn lại.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Tử các nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau:
1) Đã tiến hành thử nghiệm sử dụng các phương pháp theo quy trình 1 dựa trên cơ sở bản quyền US6573250B2, quy trình 2 và quy trình 3 dựa trên cở sở bản quyền EP0645143A1 (tách fucoidan bằng nước và tách fucoidan trong dung dich HCl pH =2) và quy trình 4 (phương pháp tách fucoidan do Nguyễn Duy Nhứt và công sự công bố), cho thấy phương pháp tách fucoidan theo quy trình 2 – sử dụng nước làm dung môi tách fucoidan thì lượng fucoidan thu được từ rong nâu S. serratum cao hơn các phương pháp thu nhận fucoidan khác.
2) Trong năm loài rong đã tiến hành khảo sát hàm lượng fucoidan thì loài rong nâu S. mcclurei có hàm lượng fucoidan thấp nhất (chỉ đạt 1.34 % trọng lượng rong khô), loài rong S. polycystum có hàm lượng fucoidan cao nhất (đạt 3.54 % trọng lượng rong khô). Còn 3 loài rong S. binderi, S. serratum, S. microcystum có hàm lượng fucoidan ở mức trung bình.
3) Đã sơ bộ đánh giá thành phần đường trung tính của fucoidan từ hai loại rong: một loại có hàm lượng fucoidan thấp nhất là S. mcclurei và một loại có hàm lượng fucoidan cao nhất là S. polycystum và nhận thấy trong fucoidan thành phần D-Fucose và D-Galactose có tỉ lệ tương đương nhau. Vì vậy không nên sử dụng thành phần D-Fucose để định lượng fucoidan mà nên tính tổng lượng fucoidan tinh chế đã sấy khô.
4) Đã sơ bộ đánh giá quá trình chiết tách và tinh sạch fucoidan từ loài rong S. polycystum và nhận thấy để chiết tách fucoidan từ loài rong S. polycystum tốt nhất nên dùng nước nóng làm dung môi chiết; để loại alginic acid cần dùng ion Ca2+ để tủa alginate, đồng thời sử dụng nhựa
trao đổi ion dương để loại bỏ ion Ca2+ dư và tách laminaral, thu fucoidan bằng cách tủa fucoidan trong môi trường EtOH 70%.
2. KIẾN NGHỊ
Do vấn đề về thời gian và kinh phí thực hiện nên trong đề tài này chỉ nghiên cứu năm loại rong phổ biến tại Khánh Hòa. Thực tế, trong khu vực tỉnh Khánh Hòa còn rất nhiều loài rong Nâu có trữ lượng lớn chưa được nghiên cứu về fucoidan. Chính vì thế, cần có những đề tài khác tiếp tục nghiên cứu về fucoidan trong các loài rong Nâu khác trong khu vực tỉnh, để tìm ra nhiều nguồn nguyên liệu có giá trị kinh tế cao trong công nghiệp sản xuất fucoidan.
Từ quá trình nghiên cứu ở trên cho phép kiến nghị là cần tiếp tục nghiên cứu thu nhận fucoidan từ rong nâu S. polycystum để có thể xây dựng một quy trình thu nhận fucoidan ở quy mô công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Hữu Đại (1997), Rong mơ (sargassaceae) Việt Nam nguồn lợi và sử dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Hữu Đại (2007), Thực vật chí Việt Nam – Tập 11, Bộ rong
Mơ –Fucales Kylin. Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 67.
3. Phạm Thị Hà (2010), Bài giảng phân tích công cụ, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng.
4. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, Nxb. Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung (2007), “Phân lập đặc điểm fucoidan từ năm loài rong mơ ở miền Trung”, Tạp chí Hóa học, 45(3), tr. 339-343.
6. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung (2008), “Fucoidan từ rong Nâu Sargassum swartzii: phương pháp tách, hoạt tính gây độc tế bào ung thư và nghiên cứu cấu trúc”, Tạp chí Hóa học,
46(1), tr. 52-56.
7. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thùy, Nguyễn Mạnh Cường,Trần Văn Sung (2009), “Nghiên cứu cấu trúc của fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tách từ rong Nâu Sargassum swartii bằng phương pháp phối khổ nhiều lần”, Tạp chí Hóa học, 47(3), tr. 300-307.
8. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2005), Rong biển dược liệu Việt Nam, nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
9. Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Năm (2007), “Fucoidan – polysaccharide chiết từ rong Nâu, sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, ứng dụng trong y học và nuôi trồng thủy sản”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 45 (1), tr. 39-46.
10. Aisa Y., Miyakawa Y., Nakazato T., Shibata H., Saito K., Ikeda Y., Kizaki M. (2005), American Journal of Hematology. 78(1):7-14, Jan Department of Internal Medicine, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan, Fucoidan induces apoptosis of human HS-sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways.
11. Beress A., Wassermann O., Tahhan S., Bruhn T., Beress L., Kraiselburd EN., Gonzalez LV., de Motta GE., Chavez PI. (1993), A new procedure for isolation of anti HIV compounds from the marine alga fucus vesiculosus, Journal of natural product 56:478-88.
12. Bo Li, Fei Lu, Xinjun Wei and Ruixiang Zhao (2008), “Fucoidan: Structure and Bioactivity”, Molecules, 13, 1671-1695; DOI: 10.3390/molecules13081671.
13. Bui Minh Ly, Ngo Quoc Buu, Nguyen Duy Nhut, Pham Du Thinh and Tran Thi Thanh Van, “Studies on fucoidan and its production from Vietnamese brown seaweeds”, Asean journal on science & technology for the development vol.22 No.4 December 2005.
14. Clinical microbiology reviews, Apr. 1995, p. 200–239 Antiviral Therapy for Human Immunodeficiency Virus Infections.
15. Colliec, S. et al. (1991),"Anticoagulant Properties of a Fucoidan Fraction", Thromb Responsibilities : 64(2):143-54.
16. Daisuke Tachikawa, Masaji Nakamizo, Makoto Fujii (2004), Anti- Tumor Activity and Enhancement of NK Cell Activity by Fucoidan, 12th International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS.
17. Dararad Choosawad, Ureporn Leggat, Chavaboon Dechsukhum, Amornrat Phongdara and Wilaiwan (2005), ChotigeatAnti-tumour activities
of fucoidan from the aquatic plant Utricularia aurea lour Songklanakarin J. Sci. Technol., Dec. 27(Suppl. 3) : 799-807.
18 Fujimura, T. et al. (2000), "Fucoidan is the active component of focus vesiculosus that promotes contraction of fibroblast - populated collagen gels", Biological Pharmacology Bulleton ( Oct): 23 (10): 1180-4.
19. Investment Promotion Agency of Administrative Committee of Yantai Economic & Technological Development Area, August 3, 2007, http://www.yantaiinvest.gov.cn/htm_eng/project_auto_1.htm.
20. Itoh, Hiroko, Noda, Hiroyuki, Amano, Hideomi, Zhuaug, Cun, Mizuno, Takashi, Ito, Hitosh (1993), “Antitumor activity and immunological properties of marine algal polysaccharides, especially fucoidan, prepared from Sargassum thunbergii of Phaeophyceae”, Anticancer Res. 13(6A):2045-52.
21. Kobayashi T., Honke K., Miyazaki T., Matsumoto K., Nakamura T., Ishizuka I., Makita A. (1994), “Hepatocyte growth factor (HGF) specifically binds to sulfoglycolipids”, J. Biol chem Apr 1;269(13): 9817-21 .
22. Koyanagi S., Tanigawa N., Nakagawa H., Soeda S., Shimeno H. (2003), “Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angigogenic and antitumor activities biochemical pharmacology”, 65: 173-179.
23. Lionel Chevolot, Alain Foucault, Frederic Chaubet, Nelly Kervarec, Corinne Sinquin, Anne-Marie Fisher, Catherine Boisson-Vidal. (1999), “Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity”, Carbohydrate Research 319: 154–165.
24. M.E.Preobrazhenskaya, A.E.Berman, V.I.Mikhailov, N.A.Ushakova, A.V.Mazurov, A.V.Semenov, A.I.Usov, N.V.Bovin, etc (1997), Fucoidan inhibits leukocyte recruitment in a model peritoneal.
25. Maruyama, Hiroko, Tamauchi, Hidekazu; Hashimoto, Minoru; Nakano, Takahisa (2003), “Antitumor activity and immune response of
Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll of Undaria pinnatifida”, In Vivo 17(3), 245-249.
26. Noda, Hiroyuki, Amano, Hideomi, Arashima, Koichi, Nisizawa,