fucoidan
Tôi tiến hành bố trí thí nghiệm trên hai loài rong S. polycystum và S. mcclure theo sơ đồ bố trí thí nghiệm hình 2.7.
Hình 2.7. Sơ dồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần đường trung tính trong fucoidan của hai loài rong S. polycystum và S. mcclurei
S. mcclurei S. polycystum Rong khô H2O2: 25 ml CaCl2: 100g Thời gian: 45’ Rong khô/nước: 1/8 NaOH 30%: 50ml Thời gian: 2h Dịch
Lọc nhựa trao đổi ion dương Rửa, loại bỏ tạp chất
Ngâm
Lọc vải Xay
Lọc cát và than hoạt tính 2 lần
Tủa Fucoidan bằng nhựa Benzalkonium chloride
Rửa giải Bã
Thuyết minh quy trình
Rửa và loại bỏ tạp chất
Cân mỗi loại 1kg rong loài S. polycystum và S. mcclurei, đem rửa vài lần trong nước máy. Trong quá trình rửa loại bỏ tạp chất như cát, sạn, san hô chết… và các loại rong tạp.
Ngâm
Mỗi loài rong biển sau khi rửa được cho vào ngâm trong nước máy trong thời gian 1 giờ. Sau đó, ta đổ lượng nước ngâm này đi.
Sau khi ngâm rong 1 giờ trong nước máy, ta tiếp tục thêm 8 lít nước; đồng thời bổ sung thêm dung dịch 50 ml NaOH 30%.
Xay
Nâng nhiệt độ của hỗn hợp rong và nước lên 700C trước khi tiến hành xay. Vì ở nhiệt độ trên 700C thì các polysaccharide mới có thể giải phóng triệt để.
Xay rong bằng máy xay có lưỡi dao cắt chuyển động xoay quanh trục cố định. Thời gian xay là 45 phút. Trong 45 phút xay rong, ta bổ sung 25 ml dung dịch H2O2 . Vì alginate kết tủa với canxi trong điều kiện trung tính, nên ta cần trung hòa hỗn hợp rong xay trước khi cho 100g CaCl2 .
Lọc vải
Hỗn hợp rong sau khi xay được đem lọc qua vải, thu phần dịch, bỏ bã. Quá trình lọc qua vải còn loại bỏ một phần tủa alginate. Tủa alginate sẽ theo phần bã được loại bỏ đi. Tuy nhiên quá trình lọc vải không thể loại bỏ hoàn toàn tủa alginate và bã rong. Trong dịch rong vẫn còn chứa các chất rắn lơ lửng và các tủa alginate mịn. Chính vì thế, dịch rong cần được lọc qua cột cát và than hoạt tính.
Lọc cát và than hoạt tính
Dịch rong sau khi lọc vải được lọc qua cột cát và than hoạt tính hai lần. Quá trình lọc này giúp loại bỏ các tủa alginate mịn và các chất rắn nhỏ lơ lửng trong dịch. Sau khi lọc một thời gian, cột cát và than hoạt tính bị tắt nghẽn; ta cần phải rửa sạch cát và than hoạt tính trước khi tiến hành lọc tiếp.
Lọc nhựa trao đổi ion dương
Dịch rong được lọc qua cột nhựa trao đổi ion dương để loại bỏ muối trong dung dịch. Do các hạt nhựa trao đổi ion dương có chứa các gốc âm, có khả năng liên kết với các ion dương như Ca2+ do muối điện li, nên giữ chúng trên bề mặt hạt nhựa.
Tủa fucoidan
Dịch rong sau khi lọc qua nhựa trao đổi ion dương được đem tủa bằng nhựa benzalkonium chloride đến tủa hoàn toàn. Dùng gậy sạch khuấy đều dung dịch, rồi tiến hành để lắng trong 24h. Sau thời gian để lắng, tủa fucoidan – benzalkonium chloride được lọc qua vải lọc thô. Rửa sạch kết tủa bằng nước cất, các chất khác như 1-3beta gulucan, polyphenol sẽ tan trong dịch và bị loại.
Rửa giải
Muối sẽ được đưa vào để rửa giải fucoidan tan ra dung dịch. EtOH có tác dụng kết tủa fucoidan, muối được trộn trong EtOH sẽ đẩy fucoidan ra, nhựa lỏng tan vào EtOH và EtOH làm kết tủa fucoidan không có nhựa, tức là kết tủa fucoidan - nhựa lỏng sẽ trở thành kết tủa fucoidan trong EtOH, còn nhựa tan vào dịch EtOH và muối.
Rửa kết tủa nhiều lần bằng EtOH 85% (v/v) để hòa tan hết muối và nhựa lỏng còn dính trong fucoidan (nếu rửa bằng ethanol tuyệt đối thì muối sẽ kết tủa theo fucoidan chứ không tan ra dung dịch). Lần cuối cùng dùng EtOH tuyệt đối hoặc aceton để rửa, nước bị hút hết vào EtOH, fucoidan được đem
sấy khô thu được fucoidan tinh sạch.
Phân tích thành phần đường của fucoidan sạch:
Mẫu fucoidan tinh sạch được gửi đi xác định thành phần đường bằng phương pháp sắc ký khí trên máy GC-17A Shimadzu tại Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang.