2.2.1. Các hóa chất sử dụng
- Dung dịch axit HCl đậm đặc 36-46%: sử dụng dung dịch axit HCl thí nghiệm xuất xứ Trung Quốc.
- Dung dịch H202 xuất xứ Thái Lan - NaOH
- EtOH 90% (v/v), EtOH 85% (v/v)
- Muối natri cacbonate xuất xứ Trung Quốc
- Nhựa trao đổi ion dương PUROLITE xuất xứ Anh - Muối NaCl
- Muối canxi clorua xuất xứ Trung Quốc đạt tiêu chuẩn sau:
Bảng 2.1. Chỉ tiêu chất lượng của muối canxi clorua
Các chỉ tiêu Yêu cầu
Nhận dạng Chất bột màu trắng
Hàm lượng chất chính (%) 95 pH trong dung dịch 10% CaCl2 ≤ 8.5
Hàm lượng cặn (%) ≤ 2
Độ hòa tan Tan trong nước ngọt và nước biển
- Nhựa benzalkonium chloride (BKC) có công thức hóa học C31H38CIN. Không màu hoặc hơi vàng nhạc. Hàm lượng Amoni ≤ 3. pH: 6 – 8.
2.2.2. Máy móc thiết bị
- Máy sắc kí khí GC – 17A Shimadzu FID với cột không phân cực. - Thiết bị lọc rây phân tử MWCO 30kDa, 1kDa
- Máy xay Philips - Máy xay rong pilet
- Lò sấy có thiết bị điều chỉnh nhiệt độ. - Bếp điện
- Lưới amiang - Cốc thủy tinh
- Đũa thủy tinh, ống đong - Lọ chứa mẫu
- Giấy lọc, phễu lọc
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Khảo sát các phương pháp định lượng hàm lượng fucoidan
Nguyên tắc của phương pháp tách chiết fucoidan theo bản quyền này là sử dụng nước nóng để chiết rút fucoidan trong rong biển. Caxi chlorua được sử dụng để tách alginate và được bổ sung ngay trước công đoạn thổi hơi nóng; loại bỏ các chất có phân tử lượng nhỏ như muối CaCl2 dư bằng cách cho dịch rong chạy qua thiết bị lọc rây phân tử. Tủa fucoidan bằng EtOH ở nồng độ thích hợp.
Hình 2.1. Quy trình chiết tách fucoidan theo bản quyền US6573250B2
Do điều kiện máy móc thiết bị của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang còn hạn chế nên bản quyền US6573250B2 được biến đổi cho phù hợp với điều kiện vật chất theo quy trình được thuyết minh ở phần dưới. Từ đây tôi gọi quy trình biến đổi theo bản quyền US6573250B2 là quy trình 1.
Lọc rây phân tử với màng 30kDa, chạy đến khi còn 50 ml thêm nước thành 200 ml, chạy đến còn 60 ml, lặp lại 3
lần.
1kg sản phẩm khô
(65% fucoidan và 33% U-fucoidan) Chiết rắn lỏng trên thiết bị chiết Westfalier Thổi hơi nóng (21 – 900C) vào trong 40 phút
Giữ 90 – 950C trong 1 giờ Làm nguội
Rong khô: 50g CaCl2: 13.75g Nước máy: 2250 ml
Thuyết minh quy trình
Bột rong
Cân 50g rong khô đã xay thành bột cho vào cốc thủy tinh. Dùng ống đong đong đúng 2250 ml nước máy cho vào hòa trộn với bột rong. Cân 13.75g CaCl2, hoà trộn với nước.
Thổi hơi nóng
Thổi hơi nóng vào mẫu với nhiệt độ là 21 - 900C trong vòng 40 phút. Sau 40 phút tiến hành giữ mẫu ở nhiệt độ 900C trong thời gian là 1 giờ, sau đó làm nguội mẫu. Sau khi mẫu đã nguội thì tiến hành lọc vải thô để loại bỏ kết tủa alginate và bã rong.
Lọc qua cột cát và than hoạt tính
Lúc này trong dịch rong vẫn còn tồn tại các tạp chất có khối lượng phân tử lớn và quan trọng hơn là chúng không phải là fucoidan cần thu nên cần phải loại bỏ chúng ra khỏi dịch rong bằng cách lọc dịch qua cột cát và than hoạt tính.
Lọc rây phân tử
Dịch rong sau khi lọc qua cột cát và than hoạt tính cần cho chạy qua thiết bị lọc rây phân tử MWCO 30kDa để tách muối đến khi còn 50 ml dịch rong, thêm vào 200ml nước cất, cho chạy đến khi còn 60 ml, lặp lại 3 lần.
Tủa fucoidan
Sau đó cho EtOH vào dịch rong ở nồng độ 70% để tủa fucoidan.
Gạn tủa và sấy
Để 1 thời gian cho kết tủa lắng xuống hết, gạn bỏ lớp cồn phía trên. Sau khi tủa cồn xong thì tiến hành thu fucoidan bằng cách cho tủa qua thiết bị lọc hút chân không để loại cồn. Tuy nhiên khi hút chân không xong thì fucoidan vẫn còn rất ẩm, vì vậy cần tiến hành cho fucoidan vào sấy ở 500C trong 18 giờ đến khối lượng không đổi.
2.3.1.2. Bản quyền EP0645143A1
Nguyên tắc của phương pháp này là chiết tách fucoidan ở nhiệt độ cao với các dung môi chiết khác nhau là nước và axit HCl. Caxi chlorua được sử dụng để tách alginate; loại bỏ các chất có phân tử lượng nhỏ như muối CaCl2 dư bằng cách cho dịch rong chạy qua thiết bị lọc rây phân tử. Tủa fucoidan bằng EtOH ở nồng độ thích hợp.
Hình 2.2. Quy trình chiết fucoidan theo bản quyền EP0645143A1
Đun nóng ở 1000C từ 10 đến 60 phút
Ly tâm loại bỏ bã rong
+ CaCl2 đạt 0.5 đến 1g/l. Ly tâm loại bỏ acid aginic.
Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất.
Đông khô hoặc tạo kết tủa với 2 lần thể tích EtOH
Sấy chân không
Fucoidan Đun nóng 25-1000C 10 đến 60 phút. pH = 2 Ly tâm loại bỏ bã rong + CaCl2 đạt 0.5 đến 1g/l. Ly tâm loại bỏ acid aginic
Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất.
Đông khô hoặc tạo kết tủa với 2 lần thể tích EtOH
Sấy chân không
Fucoidan Huyền phù
nước:rong = 3
Huyền phù dd HCl:rong = 3
Do điều kiện máy móc thiết bị của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang còn hạn chế nên bản quyền EP0645143A1 được biến đổi cho phù hợp với điều kiện vật chất theo hai quy trình được thuyết minh ở phần dưới. Từ đây tôi gọi hai quy trình biến đổi theo bản quyền EP0645143A1 sử dung nước và axit HCl làm dung môi chiết lần lượt là quy trình 2 và quy trình 3.
Thuyết minh quy trình
Quy trình 2
Chuẩn bị mẫu
Cân 50g rong khô đã xay thành bột hòa trộn với 1154 ml nước máy rồi cho vào bình thủy tinh.
Đun nóng
Đun nóng mẫu trong bình thủy tinh bằng bếp điện ở 1000C trong vòng 45 phút. Khi đạt được nhiệt độ là 1000C trong thời gian 45 phút thì ngưng lại không đun nữa, sau đó để nguội và ly tâm loại bỏ bã rong.
Loại axit alginic
Dịch rong thu được sẽ loại bỏ acid alginic bằng cách cho CaCl2 vào dịch. Kết tủa thu được là alginate sẽ được tách ra khỏi dịch rong bằng ly tâm hoặc lọc vải, tiếp tục cho dịch rong chạy qua cột cát và than hoạt tính.
Lọc rây phân tử
Dịch rong sau khi lọc qua cột cát và than hoạt tính cần cho chạy qua thiết bị lọc rây phân tử MWCO 30kDa để tách muối đến khi còn 20 ml dịch rong, thêm vào 200ml nước cất, cho chạy đến khi còn 30 ml, lặp lại 3 lần.
Tủa fucoidan
Tiến hành kết tủa dịch rong bằng EtOH 900 với thể tích gấp hai lần thể tích dịch rong. Để lắng 24h, sau đó sẽ gạn hết cồn lớp trên.
Sấy
lượng không đổi.
Quy trình 3
Chuẩn bị mẫu
Lấy 50g bột rong khô cho vào bình tam giác. Chuẩn bị dung dịch HCl có PH = 2 với thể tích cần cho thí nghiệm này là 1154 ml.
Đun nóng
Đun mẫu ở nhiệt độ từ 25 – 1000C trong vòng 10 đến 60 phút. Lọc vải loại bỏ bã rong.
Loại axit alginic
Dịch thu được cũng được kết tủa loại alginate bằng cách cho CaCl2 vào dịch với khối lượng CaCl2 là 5g. Lọc vải để loại bỏ alginate và tiến hành lọc dịch thu được qua cột cát và than hoạt tính. Khi dịch rong đã được lọc 2 lần qua cột cát và than hoạt tính.
Lọc rây phân tử
Dịch rong sau khi lọc qua cột cát và than hoạt tính cần cho chạy qua thiết bị lọc rây phân tử MWCO 30kDa để tách muối đến khi còn 20 ml dịch rong, thêm vào 200ml nước cất, cho chạy đến khi còn 30 ml, lặp lại 3 lần.
Tủa fucoidan và sấy
Tiến hành kết tủa fucoidan bằng EtOH 900 với thể tích gấp hai lần thể tích dịch rong. Để lắng kết tủa và gạn lấy kết tủa đem đi hút chân không và sấy đến khối lượng không đổi.
2.3.1.3. Định lượng fucoidan theo quy trình tách chiết của Nguyễn
Duy Nhứt và cộng sự
Để khảo sát các phương pháp định lượng fucoidan tôi sử dụng phương pháp chiết tách fucoidan đã được Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự sử dụng năm 2007 [5].
loãng ở nhiệt độ phòng. Tủa alginate và fucoidan bằng nhựa benzalkonium chloride, rồi dùng muối CaCl2 và NaCl để rửa giải tủa. Thu fucoidan theo cách kết tủa bằng EtOH ở nồng độ thích hợp và sấy fucoidan đến khối lượng không đổi. Tôi gọi quy trình tách chiết fucoidan của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự là quy trình 4.
Hình 2.3. Quy trình chiết tách fucoidan của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị mẫu
50g bột rong được đem trộn đều với 500 ml dung dịch axit HCl 0.1N.
Ngâm
Mẫu được ngâm 24 giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng có khuấy trộn.
Li tâm và lọc rây phân tử
Tủa nhựa benzalkonium chloride
Sấy Ngâm 24h
Li tâm tách bã
Lọc qua thiết bị lọc rây phân tử 1kDa đến còn 50ml
Rửa giải tủa
Tủa fucoidan EtOH : dịch rong = 2:1 Bột rong: 50g
Dịch rong được tách ra khỏi bã rong và cô đặc bằng thiết bị lọc rây phân tử MWCO 1kDa đến khi còn 50 ml.
Tủa nhựa benzalkonium chloride
Nhựa benzalkonium chloride được cho vào dịch trên đến khi không còn tạo kết tủa. Kết tủa được rửa với nước để loại bỏ laminaral và mannitol.
Rửa giải tủa
Sau đó dung dịch CaCl2 3M, NaCl 3M được đưa vào và đun nóng ở 600C, có khuấy trộn trong 2 giờ và để qua đêm. Muối benzalkonium chloride – fucoidan, benzalkonium chloride – alginic bị phá hủy giải phóng ra fucoidan, đồng thời caxi alginate được tách ra dưới dạng kết tủa. Ly tâm để thu dịch có chứa fucoidan.
Tủa fucoidan
Hai lần thể tích EtOH 900 so với thể tích dịch lọc được đưa vào và khuấy trộn trong 10 phút. Để lắng 24 giờ, kết tủa fucoidan tạo thành.
Gạn thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80% đến khi không còn ion Cl-.
Sấy
Sấy tủa fucoidan ở 500C trong 18 giờ đến khối lượng không đổi.
2.3.2. Xác định thành phần đường của fucoidan
Nguyên lí của phương pháp này là tách chiết fucoidan ra khỏi rong Nâu, rồi thủy phân fucoidan thành đường bằng inositol, TFA. Dùng thiết bị sắc kí khí GC – 17A Shimadzu FID với cột không phân cực để xác định thành phần và hàm lượng đường trong mẫu.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp sắc ký là dựa vào sự khác biệt của ái lực của các cấu tử trong hỗn hợp chất cần phần tích với pha động và pha tĩnh. Pha động là chất khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất lỏng nhớt được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt chất rắn nhỏ được nhồi vào
cột có tác dụng giữ chất ở lại. Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động. Sự tác động này đối với từng cấu tử khác nhau là khác nhau. Vì vậy khi cho hỗn hợp chất cần phân tích đi qua bề mặt pha tĩnh thì các cấu tử sẽ bị tách khỏi nhau, từ đó có thể định tính cũng như định lượng chúng.
Định tính thành phần đường trong fucoidan bằng cách só sánh thời gian lưu của chất phân tích với chất chuẩn.
Mỗi chất được xác định bằng píc trên sắc ký đồ, qua hệ thống phân tích xử lý số liệu, các peak sẽ được tính diện tích, chiều cao. Dựa vào các số liệu đó ta có thể tính toán được hàm lượng của mỗi chất.
Hình 2.4. Quy trình xác định thành phần đường trung tính trong fucoidan của rong Nâu
Lọc nhựa trao đổi ion dương Rửa, loại bỏ tạp chất Ngâm Lọc vải Xay Lọc cát và than hoạt tính 2 lần Rong khô
Tủa Fucoidan bằng nhựa Benzalkonium chloride
Rửa giải Rong khô/nước: 1/8 NaOH/rong khô:1/20 Thời gian: 2h H2O2/rong khô: 1/40 CaCl2/rong khô: 1/10 Thời gian: 45’ Dịch Bã
Thuyết minh quy trình
Rửa và loại bỏ tạp chất
Lấy một khối lượng rong biển đem rửa vài lần trong nước máy. Trong quá trình rửa loại bỏ tạp chất như cát, sạn, san hô chết… và các loại rong tạp.
Ngâm
Rong biển sau khi rửa được cho vào ngâm trong nước máy trong thời gian 1 giờ. Sau đó, ta đổ lượng nước ngâm này đi. Mục đích của quá trình ngâm này là làm hòa tan muối biển vào trong nước ngâm. Như chúng ta đã biết, hàm lượng muối cao sẽ gây cản trở và làm hòa tan trở lại tủa fucoidan. Chính vì thế, để đơn giản quá trình tinh sạch Fucoidan cần loại bỏ bớt hàm lượng muối qua công đoạn này.
Sau khi ngâm rong 1 giờ trong nước máy, ta tiếp tục thêm nước với tỉ lệ rong/ nước là 1/8; đồng thời bổ sung thêm dung dịch NaOH 30% với tỉ lệ NaOH/rong là 1/20. Bổ sung NaOH vào trong lúc ngâm rong với mục đích làm mềm rong, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xay. Đồng thời, kiềm còn có tác dụng phá vỡ cấu trúc tế bào rong biển, tạo thuận lợi cho việc giải phóng các chất cần thiết.
Xay
Nâng nhiệt độ của hỗn hợp rong và nước lên 700C trước khi tiến hành xay. Vì ở nhiệt độ trên 700C thì các polysaccharide mới có thể giải phóng triệt để.
Xay rong bằng máy xay có lưỡi dao cắt chuyển động xoay quanh trục cố định. Thời gian xay là 45 phút. Trong 45 phút xay rong, ta bổ sung dung dịch H2O2 với tỉ lệ H2O2/rong là 1/40. H2O2 là một chất oxi hóa mạnh. Bổ sung H2O2 vào trong quá trình xay với mục đích là tẩy màu dịch rong. Trong quá trình xay ta cũng đồng thời tủa alginate. Vì alginate kết tủa với canxi trong
điều kiện trung tính, nên ta cần trung hòa hỗn hợp rong xay trước khi cho CaCl2 với tỉ lệ CaCl2/rong là 1/10 vào thùng xay.
Lọc vải
Hỗn hợp rong sau khi xay được đem lọc qua vải, thu phần dịch, bỏ bã. Quá trình lọc qua vải còn loại bỏ một phần tủa alginate. Tủa alginate sẽ theo phần bã được loại bỏ đi. Tuy nhiên quá trình lọc vải không thể loại bỏ hoàn toàn tủa alginate và bã rong. Trong dịch rong vẫn còn chứa các chất rắn lơ lửng và các tủa alginate mịn. Chính vì thế, dịch rong cần được lọc qua cột cát và than hoạt tính.
Lọc cát và than hoạt tính
Dịch rong sau khi lọc vải được lọc qua cột cát và than hoạt tính hai lần. Quá trình lọc này giúp loại bỏ các tủa alginate mịn và các chất rắn nhỏ lơ lửng trong dịch. Sau khi lọc một thời gian, cột cát và than hoạt tính bị tắt nghẽn; ta cần phải rửa sạch cát và than hoạt tính trước khi tiến hành lọc tiếp.
Lọc nhựa trao đổi ion dương
Dịch rong được lọc qua cột nhựa trao đổi ion dương để loại bỏ muối trong dung dịch. Do các hạt nhựa trao đổi ion dương có chứa các gốc âm, có khả năng liên kết với các ion dương như Ca2+ do muối điện li, nên giữ chúng trên bề mặt hạt nhựa.
Tủa fucoidan
Dịch rong sau khi lọc qua nhựa trao đổi ion dương được đem tủa bằng nhựa benzalkonium chloride đến tủa hoàn toàn. Dùng gậy sạch khuấy đều dung dịch, rồi tiến hành để lắng trong 24h. Sau thời gian để lắng, tủa fucoidan – benzalkonium chloride được lọc qua vải lọc thô. Rửa sạch kết tủa bằng nước cất, các chất khác như 1-3beta gulucan..polyphenol sẽ tan trong dịch và bị loại.
Rửa giải
Muối sẽ được đưa vào để rửa giải fucoidan tan ra dung dịch. Tuy nhiên, đưa nước vào sẽ làm kết tủa lơ lửng, nhầy rất khó thu nhận.