Thí nghiệm cảm nhiễm ngược với chủng vi khuẩn đã phân lập được từ cá bệnh

M Ở ĐẦU

c. Nhuộm các tiêu bản mô bệnh họ

2.2.5 Thí nghiệm cảm nhiễm ngược với chủng vi khuẩn đã phân lập được từ cá bệnh

a. Chủng vi khuẩn dùng cho cảm nhiễm:

Từ các tiêu bản phết mô của mang, gan, thận và lách của cá bệnh và từ kết quả nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm thu từ nội tạng của cá bệnh và cá khỏe, có 2 loại vi khuẩn được dùng để cảm nhiễm ngược vào cá khỏe:

Loại vi khuẩn nghi ngờ thứ nhất (VK 1): là trực khuẩn dài (2 – 20µ), phân Mẫu cá bệnh và cá khỏe được giải phẫu Gắn tiêu bản bằng bomcanada Đọc tiêu bản trên kính hiển vi quang học. So sánh biến

đổi mô học của cá bệnh và cá khỏe Cố định mẫu trong dung dịch Bouin 24h và giữ mẫu trong cồn 70% Xử lý mẫu và thấm paraphin Đúc mẫu Cắt mẫu bằng microton (5-6µ) Nhuộm bằng Hematoxyline và Eosin hoặc Ziehl-Neelsen

khuẩn kháng acid), đã phân lập được trên môi trường Ogawa (là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn kháng acid). Loại vi khuẩn này cũng đã gặp ở hầu hết các tiêu bản phết từ mô nội tạng (lách, gan, thận, mang, cơ gần khối u cột sống) của cá CVV bị bệnh đốm trắng nội tạng, trong khi đó, đã không phát hiện thấy loại vi khuẩn này trên các tiêu bản mô phết từ mô nội tạng của cá CVV khỏe.

Loại vi khuẩn nghi ngờ thứ 2 (VK2): là trực khuẩn ngắn (1-2 µ), tròn 2 đầu, Gram (-), phát triển nhầy rất mạnh xung quanh khuẩn lạc hình tròn trên môi trường dinh dưỡng tổng hợp TSA hoặc NA. Loại vi khuẩn này cũng phân lập được ở hầu hết những con cá bị bệnh, đặc biệt khi bệnh phẩm lấy từ mang cá bệnh.

b. Cá chim vây vàng khỏe dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm

Cá CVV dùng cho thí nghiệm được mua từ trại thực nghiệm của Khoa Nuôi trồng Thủy sản, đại học Nha Trang, ở phường Vĩnh Hòa. Cá thí nghiệm có kích thước khoảng 8-10 cm chiều dài và hoàn toàn không có các dấu hiệu bất thường bên ngoài cơ thể và bên trong ổ bụng. Có 5 con cá đã được giải phẫu để kiểm tra các dấu hiệu bênh lý và tìm vị trí an toàn nhất để tiêm huyền dịch vi khuẩn vào ổ bụng của cá thí nghiệm. Cá được đưa về cơ sở thực nghiệm 1 tuần để cá ổn định về sức khỏe trước khi thí nghiệm bắt đầu.

c. Tạo huyền dịch vi khuẩn dùng để tiêm cho cá

Khi đàn cá dùng cho thí nghiệm đã sẵn sàng, dùng một số khuẩn lạc mọc trên mặt nghiêng của ống nghiệm chứa chủng thuần, đưa vào nước muối sinh lý (0,85% NaCl) để tạo ra các huyền dịch có độ đục khác nhau. So độ đục này với các ống đục chuẩn của MacFaland để tạo ra các ống chứa huyền dịch với các mật độ vi khuẩn khác nhau theo mục đích của từng thí nghiệm. Giữ các ống chứa huyền dịch này ở nhiệt độ 40C cho đến khi tiêm cho cá khỏe.

d. Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện trong 2 đợt. Đợt thí nghiệm 1 thực hiện với mục đích là xác định loại vi khuẩn nào đóng vai trò là tác nhân gây ra bệnh đốm trắng nội tạng ở cá CVV (hình 2.2.4). Đợt thí nghiệm 2 thực hiện với mục đích xác định độc

lực (LD50) của chủng vi khuẩn đã gây ra bệnh đốm trắng nội tạng (VK1) và một lần nữa xác định tác nhân gây ra bệnh này ở cá CVV. (bảng 2.2.1)

Cá chim vây vàng khỏe mạnh (cỡ 8-10cm)

XÁC ĐỊNH LOẠI VI KHUẨN LÀ TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG

Nghiệm thức ĐC

(tiêm 0,1ml nước muối

sinh lý/ con cá) TN1 (tiêm VK1) (0,1ml / con cá, huyền dịch có mậtđộ 106 tế bào/ml) TN2 (tiêm VK2) (0,1ml/con cá, huyền dịch có mật độ106 tế bào /ml)

- Mỗi lô TN có 10 con cá / thùng nhựa trắng 120 lít - Sục khí liên tục 24h/ ngày

- Cá được cho ăn bằng thứcăn công nghiệp Inver (Mỹ)

- Thay nước 30% đồng loạt khi thấy chất nước trong các thùng TN đục. - Theo dõi sự biếnđộng của một số yếu tố môi trường: nhiệtđộ, độ mặn, pH - Theo dõi sự xuất hiện của các dấu hiệu và trạng thái hoạtđồng bất thường

- Theo dõi tỷ lệ cá chết hàng ngày

- Khi có cá bị bệnh và chết cần: quan sát bên ngoài, giải phẫu và chụpảnh.

Đồng thờiđưa vào phân tích vi khuẩn như phương pháp đã trình bày ở mục

2.2.3; 2.2.4.

Bảng 2.1 Cảm nhiễm ngược chủng VK1 vào cá CVV khỏe ở các mật độ vi khuẩn khác nhau Thí nghiệm (120 lít) Tên nghiệm thức Số lượng cá/ lô TN (con) Kích thước cá (cm) Mật độ của vi khuẩn (tế bào/ml) Liều tiêm (tế bào/ml) Vị trí tiêm 1 Đối chứng 10 8-10 NaCl 0,65% 0,1 Vào xoang bụng ở vị trí gốc vây bụng 2 NT1 VK1(104 ) 3 NT2 VK1 (105 ) 4 NT3 VK1(106 ) 5 NT4 CK(107 ) 6 NT5 VK1(108 ) Điều kiện thí nghiệm

- Cá thí nghiệm được cho ăn 2 lần/ngày với thức ăn tổng hợp Inver - Sục khí liên tục 24h/ ngày

- Xifon đáy thùng hàng ngày để loại bỏ thức ăn thừa

- Thay nước 30 % đồng loạt ở các NT nếu nước trong các thùng TN bị đục, bẩn

Theo dõi thí nghiệm

- Theo dõi sự biến động của một số yếu tố môi trường trong các nghiệm thức: nhiệt độ, độ mặn và pH

- Theo dõi và ghi chép sự xuất hiện của các trạng thái và dấu hiệu bất thường ở đàn cá thí nghiệm

- Ghi nhận tỷ lệ cá chết trong các lô thí nghiệm

- Đưa những mẫu cá bị bệnh hấp hối về phòng thí nghiệm để phân tích bằng phương pháp vi khuẩn học và mô bệnh học.

- Làm các tiêu bản phết mô của gan, thận, lách và nhuộm Gram, Ziehl- Neelsen

Mục đích của TN

Xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng và độc lực của vi khuẩn là tác nhân với cá chim vây vàng (Trachinotus blochii).

2.2.6. Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng

Để đánh giá vai trò là tác nhân gây ra bệnh đốm trắng nội tạng ở cá CVV của ký sinh trùng, phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng ở cá của Dogiel (1929), hoàn thiện bởi Hà ký (1993) đã được sử dụng cho nghiên cứu này.

2.2.7. Kỹ thuật kính hiển vi điện tử (KHVĐT)

Mô của các tổ chức cơ quan thu từ cá CVV bị bệnh được cố định trong dung dịch Glutahydrate với tỷ lệ về thể tích 1/10, giữ ở nhiệt độ 4-50C và gửi tới phòng KHVĐT ở trong đá khô. Quan sát, phát hiện virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope-

TEM) ở các độ phóng đại khác nhau.

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng

(Trachinotus blochii) nuôi tại Vũng Ngán, trên vịnh Nha Trang.

Từ tháng 7 đến tháng 10/ 2010, đã có 47 con cá bị bệnh với các dấu hiệu bộc lộ rõ ràng và 10 con cá khỏe, kích thước của cá từ 8-14cm, được thu từ các lồng nuôi thử nghiệm loài cá CVV trên vịnh Nha Trang.

Có một số dấu hiệu của bệnh được bộc lộ ra bên ngoài như: có nhiều nốt phồng rộp nhỏ từ phía dưới của da nhô lên, khi các nốt phồng này vỡ ra tạo nên các nốt thương tổn nhỏ màu nâu (hình 3.1). Mang cá tiết nhiều dịch nhày, có các đốm trắng nhỏ (kích thước đốm trắng 1-2mm) trên mang và đôi khi trên mang cá bệnh tồn tại các vùng bị thương tổn do hoại tử (hình 3.2). Một số con cá bệnh xuất hiện các khối u nằm dọc cột sống (hình 3.3), khi khối u này lớn lên gây chèn ép làm cơ thể cá mất đi hình dạng bình thường, cơ thể bị cong gập dị dạng (hình 3.4.). Da cá bệnh mất màu sáng bạc bình thường do mất nhớt. Mắt thường bị xuất huyết, một số con có hiện tượng lồi mắt. Các vây bụng, vây ngực, vây lưng có hiện tượng xơ mòn. Những con bệnh nặng có bụng to và cứng.

Giải phẫu trong ổ bụng của cá bệnh, nhiều đốm trắng nhỏ (đường kính 1 – 2mm) xuất hiện nhiều ở gan, lách và thận của cá bệnh đã được quan sát. Ở một số con, các đốm trắng dạng u hạt còn tìm thấy bám ở trên bề mặt của bóng hơi, ở màng treo ruột hay ở xoang bụng. Đa phần những con cá bị bệnh có đầu thận bị sưng to gấp 2-3 lần so với cá khỏe và gan có hiện tượng có hiện tượng xung huyết. (hình 3.5)

Cá CVV thường bị bệnh ở giai đoạn cá còn nhỏ, gặp nhiều ở cá có kích thước từ 7 – 15 cm chiều dài. Bệnh này thường hay xảy ra sau khi thả cá ra lồng được 1-2 tháng nuôi. Cá bệnh có một số biểu hiện bất thường về tập tính sống như: bỏ ăn, bơi tách khỏi đàn, thường bơi lờ đờ trên tầng nước mặt. Một số con có biểu hiện bơi không định hướng, bơi xoắn nhiều vòng trên mặt nước. Cá bệnh thường chết sau 3-4 ngày kể từ khi

xuất hiện dấu hiệu bệnh lý đầu tiên. Tỷ lệ cá chết tích lũy của cá dao động từ 30 – 70% (hình 3.6)

Bảng 3.1. Các dấu hiệu chính của bệnh đốm trắng trong nội tạng ở cá chim vây vàng đã quan sát được bằng mắt thường (n=47 con cá bệnh)

TT Các dấu hiệu chính của bệnh Tần số

gặp

(%)

** Các dấu hiệu quan sát từ bên ngoài 47 100

1 Xuất hiện các nốt phồng nhỏ trên da 42 89,3 2 Mang bị hoại tử và tiết nhiều dịch nhầy 30 63,8 3 Xuất hiện các đốm trắng đục nhỏ trên mang 14 29,8 4 Xuất hiện khối u dưới da, dọc theo cột sống 23 48,9 5 Cơ thể có khối u lớn nên bị uốn cong, dị dạng 9 19,1 6 Các nốt phồng bị vỡ ra tạo vết thương tổn nhỏ 33 70,2

** Các dấu hiệu quan sát trong ổ bụng 47 100

1 Đốm trắng xuất hiện ở thận cá bệnh 27 57,4

2 Đốm trắng xuất hiện ở lách cá bệnh 23 48,9

3 Đốm trắng xuất hiện ở gan cá bệnh 24 51,1

4 Gan cá có hiện tượng xung huyết 11 23,4

5 Đốm trắng xuất hiện ở mạng treo ruột và bóng hơi

7 14,9

Hình 3.1: Cá bị bệnh xuất hiện các nốt phồng rộp dưới da, sau một thời gian nốt phồng vỡ ra tạo ra các thương tổn nhỏ mẫu nâu xám .

- Các nốt phồng rộng ở da (mũi tên nhỏ)

- Các nốt phồng đã vỡ, tạo ra các vết thương tổn nhỏ mà xám (mũi tên lớn)

c

Hình 3.2. Bệnh lý bộc lộ ở mang của cá CVV bị bệnh đốm trắng nội tạng

a. Mang cá bệnh tiết nhiều dịch nhày và có các hạt trắng ở trên các tơ

mang

b. Mang cá có các vùng thương tổn do hoại tử

a b

a b

Hình 3.3 : Hình ảnh các khối u cột sống được lộ diện khi đã bóc đi phần cơ .

a. Khối u nằm trên cột sống, gần đuôi, xuất

hiện nhiều đốm trắng đục trên bề mặt

của khối u. Trên da cũng có các nốt

phồng rộp.

b. Khối u nằm trên cột sống nhưng ở phần

giữa cơ thể, có lớp trắng đục bao phủ

bên ngoài của khối u.

c. Có nhiều khối u nhỏ đang xuất hiện dọc

cột sống của cá bệnh

a b

c

Hình 3.4. Khối u ở cột sống là cá bệnh bị dị dạng (a); Trên cơ thể của 1 con cá bệnh có thể cùng lúc xuất hiện nhiều dấu hiệu khác nhau của bệnh: u cột sống, các nốt phồng rộp ở da và các thương tổn ở mang (b).

Hình 3.5. Các dấu hiệu gặp trong nội tạng của cá CVV bị bệnh:

a &b: nhiều hạt trắng nhỏ xuất hiện ở

gan của cá bệnh.

c & d: nhiều hạt trắng nhỏ đã xuất hiện ở lách cá bệnh, làm tổ chức này sưng to hơn bình thường

e. Nhiều hạt trắng nhỏ gặp ở đầu thận

của cá bị bệnh

a

c d

e b

3.2. Kết quả nghiên cứu mô bệnh học ở cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng

Có 5 con cá bệnh và 5 con cá khỏe được đưa vào nghiên cứu mô bệnh học để phát hiện các biến đổi bệnh lý trong mô của các tổ chức cơ quan ở cá CVV bị bệnh. Trong các lát cắt của thận, lách và gan của cá bệnh (với thuốc nhuộm Hematoxylin & Eosin), đã biểu hiện một dạng bệnh lý giống nhau, đó là có rất nhiều các thương tổn dạng u hạt và nhiều tế bào máu tấn công và bao vây xung quanh các vị trí thương tổn này. Dạng thương tổn này đôi khi xuất hiện dày đặc trên các tiêu bản mô bệnh học của thận, gan và lách và chắc chắn các thương tổn này tương ứng với sự tồn tại của các hạt trắng (còn gọi là các đốm trắng) trong các cơ quan này đã được phát hiện bằng mắt thường và đã được trình bày ở mục 3.1. (hình 3.7; hình 3.8; hình 3.9)

Đặc biệt, ở các tiêu bản mô bệnh học làm từ khối u xương sống của cá bệnh, các thương tổn dạng hạt đã quan sát thấy ở gan, lách và thận cũng gặp tồn tại ở các khối u xương này, nhưng vùng thương tổn lớn hơn, chèn ép làm biến dạng các tế bào của mô xương (hình 3.10).

Các biến đổi mô bệnh học ở mang của cá CVV bị bệnh lại được đặc trưng bởi sự kết dính của các tơ mang thứ cấp do dịch nhày, điều này làm giảm sự trao đổi khí qua mang của cá bệnh, điều này đã giải thích hiện tượng cá bệnh thường nổi lên tầng mặt. Ngoài ra, sự phì đại của các tơ mang sơ cấp, sự cong keo các đầu mút của các tơ mang thứ cấp do sự phình to của các tế bào biểu mô tại đây cũng đã được quan sát. Ở một số tiêu bản khác, sự hoại tử của một phần các tơ mang cũng được quan sát thấy khá rõ ràng (hình 3.11).

Bệnh lý ở cơ tại các vị trí bị phồng rộp và thương tổn dưới da cũng đã được xem xét. Những vùng mô cơ bị hoại tử, thay vào đó là các thương tổn dạng u hạt giống như đã quan sát thấy ở thận, gan và lách cũng tồn tại ở đây. (hình 3.12)

Hình 3.7: Biến đổi mô bệnh học trong tổ chức gan cá CVV bị bệnh đốm trắng nội tạng

a. Mô học của tổ chức gan ở cá khỏe (nhuộm với H&E, phóng đại 100x) b. Các thương tổn dạng u hạt tồn tại nhiều trong tổ chức gan của cá bệnh

a b

Hình 3.8: Các biến đổi mô bệnh học ở lách của cá CVV bị bệnh đốm trắng nội tạng

a. Mô học của lách ở cá khỏe (nhuộm với H&E, độ phóng đại 400x)

b. Nhiều thương tổn dạng u hạt tồn tại

trong tổ chức lách của cá bệnh (nhuộm với H&E, độ phóng đại 100x)

c. Các thương tổn dạng u hạt tồn tại nhiều

trong tổ chức lách của cá bệnh (nhuộm với

H & E, phóng đại 400x)

a b

a a

Hình 3.9: Biến đổi mô bệnh họcở thận cá chim vây vàng bị bệnhđốm trắng nội tạng

a. Mô thận của cá chim vây vàng khỏe nhuộm

với H &E (phóng đại 400x)

b. Mô thận của cá bệnh với rất nhiều các

vùng thương tổn dạng u hạt (nhuộm với H &E,

phóng đại 100x)

c. Các thương tổn dạng u hạt rất đặc thù gặp

ở mô thận (nhuộm với H&E và phóng đại)

a b

c

Hình 3.10 : Biến đổi mô bệnh học ở vị trí xương xuất hiện khối u (với H &E)

a. Khối u trên xương sống cá chim vây

vàng bị bệnh (luộc chín, gỡ thịt)

b. Mô học bình thường của xương sống, (phóngđại 400x),

c. Thương tổn dạng u hạt bắt màu tím của thuốc nhuộm hematoxylin chiếm chỗ trong mô xương, chèn ép, dồn nén các tế bào xương (phóng đại 400x)

Hình 3.11 : Các biến đổi mô bệnh họcở tổ chức của mang cá CVV bị bệnh.

a. Các tơ mang sơ cấp và thứ cấp ở cá khỏe, tơ mang thứ cấp thẳng, giữa 2 tơi mang thứ cấp có khoảng trống cho phép trao đổi nước (phóng đại 400x)

b. Tơ mang sơ cấp phình to, đầu mút các tơ

mang thứ cấp cong keo và dính bết vào nhau do dịch nhày ( phóng đại 400x)

c. Hiện tượng hoại tử xảy ra từng vùng