M Ở ĐẦU
3.3.3.4.Kết quả cảm nhiễm ngược 2 chủng vi khuẩn đã phân lập được vào cá CVV khỏe
c. Nhuộm các tiêu bản mô bệnh họ
3.3.3.4.Kết quả cảm nhiễm ngược 2 chủng vi khuẩn đã phân lập được vào cá CVV khỏe
khỏe
a. Cảm nhiễm đợt I để phát hiện chủng vi khuẩn gây bệnh
Như đã trình bày ở các mục 3.3.3.1 và 3.3.3.2, từ bệnh phẩm lấy ở gan, thận, lách và các nội tạng khác của cá CVV bị bệnh đốm trắng nội tạng, có nhiều chủng vi khuẩn đã phân lập được. Dựa vào đặc điểm khuẩn lạc, môi trường mọc, hình dạng kích thước tế bào vi khuẩn và đặc điểm nhuộm Gram và nhuộm Ziehl-Neelsen, chúng tôi đã chọn ra 2 loại vi khuẩn được nghi ngờ là tác nhân gây bệnh ở cá CVV. VK1 là các chủng vi khuẩn mọc trên môi trường Ogawa, tế bào dạng sợi dài, phân nhát và có đốt, Gram (+) và là vi khuẩn kháng acid . VK2 là chủng vi khuẩn mọc trên môi trường TSA (hay NA), khuẩn lạc màu trắng đục, dẹp, tròn và có khả năng sinh nhày rất mạnh trên đĩa nuôi cấy.
Bảng 3.2: Một số đặc điểm của 2 loại vi khuẩn đã phân lập được từ cá CVV
Một số đặc điểm VK1 VK2
1. Sinh trưởng trên môi trường
Mọc chậm trên môi trường Ogawa
Mọc tốt trên môi trường TSA hay NA 2. Thời gian xuất hiện
khuẩn lạc ở nhiệt độ 28oC
7 -10 ngày đêm 1 ngày đêm (24 h)
3. Đặc điểm khuẩn lạc Màu trắng kem, bề mặt nhăn nheo và khô
Trắng, tròn, dẹp và sinh nhày rất mạnh
4. Tế bào vi khuẩn Dài 1- 10µm (có thể tới vài chục µm), mảnh, phân nhánh và có đốt
Dài: 1-1,5 µm, thẳng hoặc hơi cong
5. Nhuộm Gram Gram (+) Gram (-)
6. Nhuộm Ziehl- Neelsen
Tế bào vi khuẩn có màu hồng của fuchsin- là vi khuẩn kháng acid
Tế bào vi khuẩn có màu xanh của methylen 7. Tần số gặp ở các mẫu
cá CVV bị bệnh (n=47)
- Bắt gặp 100% ở trong mô của nội tạng cá CVV bị bệnh. - Nhưng chỉ phân lập được VK1 trên môi trường Ogawa ở 25 trong số 47 (53,2%) con cá bệnh đưa
- Phân lập được ở 100% số con cá CVV bị bệnh đã đưa vào nghiên cứu.
vào nghiên cứu. 8. Tần số gặp ở các mẫu
cá CVV khỏe (n = 10)
- Không tìm thấy VK1 trong mô của nội tạng cá CVV khỏe.
- Hoàn toàn không phân lập được vi khuẩn VK1 trên môi trường Ogawa từ mô của cá khỏe.
- Cũng phân lập được ở mang của một số cá khỏe.
Bảng 3.2. Thể hiện một số đặc điểm của 2 loại vi khuẩn đã phân lập được ở các mẫu cá CVV nuôi tại Nha Trang bị bệnh đốm trắng nội tạng. Do cả 2 loại VK1 và VK2 đều cảm nhiễm ở 100% các mẫu cá bệnh. Tuy nhiên, VK1 là loại vi khuẩn mọc chậm, chỉ phân lập được ở một số mẫu cá bệnh (25/47), một số mẫu cá CVV bị bệnh khác lại không phân lập được (mặt dù đã phát hiện VK1 này tồn tại nhiềuở trong mô của cá).
Vì thế, 2 chủng đại diện cho 2 loại vi khuẩn nói trên (VK1 và VK2) đã được dùng để cảm nhiễm cho cá khỏe bằng cách tiêm 0,1 ml huyền dịch có mật độ 106 tế bào/ml vào ổ bụng của cá CVV (cỡ 8-10cm), ở vị trí gần gốc vây bụng. Cá ở nghiệm thức đối chứng được tiêm 0,1 ml nước muối sinh lý (0,85%). Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 28-29oC, pH 7,8 – 8,0, độ mặn 30o/oo. Bố trí thí nghiệm đã được trình bày ở chương 2 và kết quả cảm nhiễm ngược thể hiện ở hình 3.16
Kiểm tra tác nhân gây bệnh
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ngày thí nghiệ m T ỷ l ệ c h ế t tí c h l ũ y ĐC V K2 V K1
Thí nghiệm kéo dài trong 14 ngày, cá ở nghiệm thức tiêm huyền dịch VK1 (106 tế bào/ml) đã bắt đầu chết vào ngày thứ 12 kể từ khi tiêm và chết 100% vào ngày thứ 14. Trong khi đó, không có con cá nào bị chết trong suốt thời gian thí nghiệm 14 ngày ở nghiệm thức tiêm chủng VK2 và nghiệm thức đối chứng. Những con cá hấp hối hoặc đã chết ở nghiệm thức tiêm chủng VK1 đều bộc lộ các dấu hiệu giống như cá bị bệnh ngoài tự nhiên: xuất hiện các nốt phồng từ dưới da, bụng cá phình to và cứng. Mang, gan, thận, lách và các nội tạng khác đều xuất hiện các hạt trắng. Tuy nhiên không có con cá nào xuất hiện dấu hiệu u cột sống. Các tiêu bản phết mô của những con cá hấp hối đã thể hiện sự nhiễm rất nặng loại vi khuẩn đã dùng để tiêm vào cá khỏe. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ kết quả của thí nghiệm cảm nhiễm đợt 1, chúng tôi đã có thể nhận đinh rằng, tác nhân gây ra bệnh đốm trắng nội tạng của cá CVV nuôi tại Nha Trang là vi khuẩn VK1, đó là loài vi khuẩn dạng sợi, dài không đồng nhất, có thể từ 1 đến hàng chục µm, tế bào phân nhánh nhiều, có đốt, Gram (+) và kháng aicd, mọc chậm trên môi trường Ogawa và hầu như không mọc trên các môi trường dinh dưỡng thông thường. Cá thí nghiệm đã chết do hiện tượng cảm nhiễm hệ thống loài vi khuẩn này.
A B
C
b. Cảm nhiễm đợt II để xác định động lực của vi khuẩn VK1
b. Cảm nhiễm đợt 2, cảm nhiễm với chủng VK1 ở các nồng độ khác nhau.
Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn VK1, được đưa vào nước muối sinh lý vô trùng để tạo các huyền dịch với mật độ vi khuẩn khác nhau, lần lượt là: 104, 105, 106, 107 và 108 tb/ml. Cá CVV với kích cỡ từ 8-10cm được đưa từ trại thực nghiệm cá biển ở Ba Làng về cơ sở thí nghiệm để bố trí cảm nhiễm. 0,1ml của các huyền dịch nói trên được tiêm vào ổ bụng của cá ở vị trí gốc vây bụng. Mỗi nghiệm thức bố trí 10 con cá trong các xô 120 lít. Thí nghiệm được thực hiện trong thời gian thời tiết rất xấu, trời mưa tầm tã suốt ngày đêm, Nhiệt độ dao động 24- 26oC. pH: 7,4 – 7.8. Độ mặn: 28 – 30 o/ Kết
Hình 3.18: Dấu hiệu bộc lộ ở cá thí nghiệm sau khi tiêm chủng VK1 vào ổ bụng (0,1ml/cá ) với liều 106 tế bào/ml được 12 ngày: A. Cá đối chứng có da và nội tạng
bình thường: B. sau khi tiêm VK1 được 8 ngày, các nốt phồng từ dưới da của cá bắt đầu xuất hiện, sang đến ngày thứ 10, bụng cá phình to và cứng. C & D: Gan, lách và nội tạng của cá bị cảm nhiễm VK1 đã tăng thể tích và xuất hiện nhiều đốm trắng nhỏ.
E. Vi khuẩn VK1 phân lập từ cá bị bệnh trong thí nghiệm cảm nhiễm (Nhuộm Ziehl- Neelsen)
quả cảm nhiễm được trình bày dưới biểu đồ sau. Tỷ lệ chết tích lũy của cá thí nghiệm được thể hiện ở hình 3.18. 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ngày thí nghiệm tỷ l ệ c h ế t tí c h l ũ y NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 ĐC
Hình 3.19. Tỷ lệ chết tích lũy của cá khi bị cảm nhiễm chủng VK1 ở các huyền dịch có mật độ vi khuẩn khác nhau. (Trong đó 104 tb/ml (NT1), 105tb/ml (NT2), 106tb/ml(NT3), 107tb/ml (NT4), 108 tb/ml (NT5) và nghiệm thức đối chứng tiêm 0,1ml nước muối sinh lý vô trùng vào ổ bụng)
Kết quả cảm nhiễm ngược trong hình 3.18, đã một lần nữa chứng tỏ rằng, cá CVV bắt đầu chết ở ngày thứ 5 sau khi bị tiêm 0,1ml chủng VK1 ở liều cao (NT3, NT4, NT5 và NT6) và chết vào ngày thứ 7 ở nghiệm thức tiêm với liều thấp nhất (NT1: 104 tb/ml). Cá trong các nghiệm thức tiêm vi khuẩn ở đợt thứ 2 đã chết 100% vào các ngày thứ 7, 9, 10, 11 và thứ 12 tương ứng với các liều tiêm tăng dần, cá ở lô đối chứng vẫn sống 100% cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Từ kết quả trên chúng tôi tính được liều gây chết 50% ở ngày thứ 9 là LD50=3,2 x 104 tb/ml. So với đợt thí nghiệm thứ nhất, hiện tượng cá chết ở đợt thứ 2 xảy ra sớm hơn, điều này có thể liên quan tới điều kiện khí hậu, thời
tiết, đặc biệt là nhiệt độ. Đợt thí nghiệm thứ 2 trùng với thời gian mưa to kéo dài ở Nha Trang, nhiệt độ nước thấp (24-260C), các yếu tố môi trường bất lợi có thể là làm cho cá thí nghiệm mẫn cảm hơn với chủng vi khuẩn cảm nhiễm. Cá bị bệnh trong các nghiệm thức bị cảm nhiễm chủng VK1 đều bộc lộ các dấu hiệu bên ngoài và bên trong ổ bụng giống như cá bị bệnh ngoài lồng nuôi, tuy nhiên cũng không có con cá nào bộc lộ ở các khối u cột sống. Mặc dù vậy, ở những con cá bị bệnh ngoài tự nhiên, các đốm trắng dạng hạt vẫn được phát hiện trên bề mặt của các khối u cột sống (hình 3.3). Do vậy, chúng tôi cho rằng các khối u cột sống hình thành trong các dạng bệnh mãn tính, còn trong cảm nhiễm nhân tạo, một số lượng vi khuẩn không nhỏ được đưa vào cơ thể cá, cá bệnh có bệnh lý diễn biến nhanh, làm cá chết trước khi xuất hiện các khối u. Tuy nhiên, vấn đề này cần được nghiên cứu tiếp theo.
Tóm lại: Sau 2 đợt cảm nhiễm ngược chủng VK1 vào cá khỏe, đã cho phép chúng tôi kết luận rằng, VK1 là một chủng vi khuẩn có độc lực cao, đây chính là tác nhân gây ra bệnh đốm trắng nội tạng ở cá CVV nuôi tại Nha Trang.