M Ở ĐẦU
2.2.3.Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
Phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn ở cá xương của Kimberley A. Whitman (2004) đã được dùng cho phân tích các mẫu cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng [59].
a. Môi trường dùng cho phân lập vi khuẩn:
Để phân lập vi khuẩn từ cá bệnh, một số môi trường dinh dưỡng không chọn lọc như: TSA (Tryp Soy Agar), NA (Nutrient Agar) và môi trường chọn lọc như: môi trường trứng Ogawa dùng để phân lập các vi khuẩn kháng acid và môi trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt sucrose) dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio. Các môi trường dinh dưỡng tổng hợp đã có bán sẵn trên thị trường được pha chế như hướng dẫn
Nghiên cứu bệnh đốm trắng trong nôi tạng ở cá chim Vây vàng
(Trachinotus blochii) nuôi tại Vũng Ngán, Nha Trang, Khánh Hòa
Kết luận và đề xuất ý kiến Nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trong nội tạng của cá CVV Mô tả các dấu hiệu bệnh lý chính Nghiên cứu biến đổi mô bệnh họcở các tổ chức của cá bệnh. Xác định vai trò của virus Xác định vai trò của ký sinh trùng Xác định vai trò của vi khuẩn
của nhà sản xuất ghi trên nhãn mác chai đựng môi trường. Riêng môi trường Ogawa được pha chế bằng phường pháp thủ công.
Chuẩn bị môi trương Ogawa
Có 3 thành phần phối trộn nên môi trường Ogawa:
1. Dung dịch muối khoáng bao gồm có: 3g Kali đi hydro sun phát (KH2PO4); 3g Sodium glutamate, 6g NaCl hòa tan trong 300ml nước cất. Dung dịch này được hấp tiệt trùng bằng autoclave, ở nhiệt độ 121oC, trong thời gian 30 phút. .
2. Dung dịch malachite green, 2%: Hòa tan 2g bột Malachite green với 100ml nước cất đã tiệt trùng trong dụng cụ thủy tinh đã vô trùng và đặt vào trong tủ ấm 1-2 giờ.
3. Trứng: Dúng trứng gà không quá 7 ngày từ khi đẻ được làm sạch bên ngoài bằng bằng xà phòng. Sau đó ngâm tiếp trong dung dịch xà phòng 30 phút, tiếp theo rửa nước và ngâm cồn etanol 70% trong 15 phút. Cầm quả trứng đã làm sạch trên tay và làm vỡ nó bằng một con dao vô trùng, rồi cho dịch trứng vào dụng cụ vô trùng sau đó trộn đều trứng bằng một dụng cụ khuấy trứng đã vô trùng.
Trộn đều kỹ 300 ml dung dịch muối khoáng, 18ml dung dịch malachite green 2%, 600 ml trứng gà và 18ml glycerol. Điều chỉnh của pH của hỗn hợp này là 6,8, sau đó phân phối môi trường này từ 6-8 ml vào mỗi ống nghiệm đã tiệt trùng. Để ống nghiệm nghiêng một góc 450 (tạo mắt nghiêng) và làm đông các ống môi trường này bằng cách đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 80oC – 85oC trong thời gian 45 phút. Khi môi trường đã rắn lại sẽ có màu xanh lá chuối non.
b. Phương pháp nhuộm các tiêu bản phết từ mô của nôi tạng cá bệnh
** Phương pháp nhuộm của Ziehl- Neelsen: Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen đã được sử dụng để nhận biết loại vi khuẩn kháng acid (acid fast) có mặt trong tổ chức mô của cá bệnh. Các bước tiến hành như sau:
Sát trùng bề mặt cá nghiên cứu bằng miếng bông thấm cồn etanol 70%, dùng kéo vô trùng giải phẫu cá để quan sát các nội tạng như gan, lách, và thận ở bên trong ổ bụng
và não ở vùng đầu. Dùng kéo và panh vô trùng để cắt và kẹp một miếng nhỏ mô từ các tổ chức có bộc lộ bệnh lý, phết mô cắt này trên mặt của tấm lam sạch (đã được ngâm trong acid acetic đậm đặc sau 24 h, rồi rửa sạch trước khi dùng), trong một giọt nước muối sinh lý vô trùng (0,85%) để tạo một vết bôi và để khô trong không khí. Cố định tiêu bản này bằng cách đưa lamel có vết bôi qua lại 3 lần trên ngọn lửađèn cồn. Sau đó nhỏ Carbol fuchsin (0,03g fuchsin pha trong 10ml còn etylic 95%, rồi bổ sung thêm 5g phenol và 95ml nước cất) tràn trên mặt vết bôi và hơ nóng lam phết này trên ngọn lửa nhỏ để bốc hơi trong 10 phút, tuy nhiên không nên để khô vết bôi, do vậy Carbol fuchsin đã được bổ sung. Tiếp theo đưa lam mẫu rửa nhẹ nhàng với nước sạch (nước có thể dùng để uống) trước khi làm mất màu bằng acid acetíc 0,5% trong 20-30 giây. Tiếp theo nhuộm tiêu bản phết bằng Methylene blue trong 60 giây, sau đó rửa nhẹ bằng nước uống và để khô rồi quan sát ở kính hiển vi dưới vật kính dầu (100x) để phát hiện phần cơ chất của các tổ chức vật chủ bắt màu xanh của methylene blue (0,3g bột methylene blue pha trong 100ml nước cất), các khuẩn lạc hay các tế bào của vi khuẩn kháng acid bắt mầu hồng tím của Fuchsine.
** Phương pháp nhuộm Gram: Phương pháp này nhằm nhận dạng ra các tế bào hay khuẩn lạc vi khuẩn trong mô của vật chủ và xếp vi khuẩn đó vào 1 trong 2 nhóm: Gram (+) hoặc Gram (-). Các thao tác được tiến hành như sau: Cắt một miếng mô nhỏ từ các tổ chức của cá bệnh có bộc lộ bệnh lý, dùng kẹp phết mô này lên mặt của tấm lam sạch (đã được ngâm trong acid acetic đậm đặc sau 24 h, rồi rửa sạch trước khi dùng) trong một giọt nước muối sinh lý vô trùng (0,85%), để tạo một vết bôi và để khô trong không khí. Cố định tiêu bản này bằng cách đưa lamel có vết bôi qua lại 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ tràn thuốc nhuộm tím crystal ( bao gồm: 2g tím crystal hòa tan trong 20ml cồn etylic, sau đó trộn lẫn với 80 ml dung dịch ammonium oxalate 1% trong nước cất) lên bề mặt của vết mô phết và để vậy trong 30-60 giây. Sau đó rửa nhẹ bằng nước vòi, vẩy khô. Nhỏ tràn dung dịch lugol lên bề mặt của vết mô phết trong 1 phút sau đó rửa nhẹ và vẩy khô nước. Tiếp tục làm mất màu tím bằng cồn-aceton rồi rửa nhẹ và vẩy khô. Sau đó nhỏ tràn thuốc nhuộm Fuchsin trên vết mô phết trong 1- 2 phút. Cuối cùng
rửa nước chảy nhẹ, để khô tự nhiên và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100x trong dầu. Vi khuẩn Gram (+) có mầu tím và vi khuẩn Gram (-) có mầu hồng.
Mẫu bệnh phẩm: (gan, thận, lách, não, cơ)
Kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn bằng các phản ứng
sinh hóa truyền thống
Làm tiêu bản nhuộm Gram và nhuộm Ziehl-Neelsen . Làm các tiêu bản phết từ mô
gan, thận, lách, não, cơ Nuôi cấy phân lập trên các loại
môi trường TSA, NA, TCBS, OGAWA
Định danh chủng vi khuẩn này dựa vào hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey
Tạo các chủng thuần từ các khuẩn lạc rời
Cảm nhiễm ngược các chủng vi khuẩn đã phân lập được bị nghi ngờ là tác nhân gây bệnh vào cá khỏe
Hình 2.2 : Sơ đồ khối mô tả các bước thực hiện khi nghiên cứu tác nhân vi khuẩn từ cá bệnh
c. Phương pháp phân lập vi khuẩn. từ cá bệnh
Bệnh phẩm thu từ gan, thận, lách và mang của cá bệnh được dùng để cấy trên các môi trường phân lập trong các đĩa lồng chứa môi trường TSA (hoặc NA) và TCBS và cấy trên mặt nghiêng của môi trường Ogawa trong các ống nghiệm. Các môi trường sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 26 – 28oC. Sau 24-48h, vi khuẩn đã bắt đầu mọc trên các đĩa lồng chứa môi trường TSA (hay NA) và TCBS, nhưng sau 7 ngày kể từ khi cấy phân lập, các khuẩn lạc khô và nhăn nheo trên bề mặt mới xuất hiện trên mặt nghiêng của môi trường Ogawa. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các chủng vi khuẩn thuần được tách ra từ các khuẩn lạc rời và lại được ủ ở nhiệt độ 280C trong 24h (với các chủng vi khuẩn tách từ đĩa phân lập chứa môi trường TSA và TCBS, trong 7 - 10 ngày với các chủng tách ra từ ống phân lập chứa môi trường Ogawa. Khi các khuẩn lạc xuất hiện trong các ống nghiệm chứa chủng thuần, các tiêu bản ép tươi và nhuộm Gram, nhuộm Ziehl-Neelsen được thực hiện để kiểm tra hình dạng, cách sắp xếp và cách bắt màu của vi khuẩn.
Các phản ứng sinh hóa truyền thống như OF, KIA, Mantiol di động, catalase, oxidase, và khả năng lên men các loại đường như: Arabinose, glucose, sucrose, galactose, manose, maltose đã được thực hiện làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn theo hệ thống phân loại của Bergey được trình bày bởi Holt J.G &CTV (xuất bản lần thứ 9,1994).