3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian
Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase theo thời gian, chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng khoáng MTK
ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Dịch enzyme đƣợc thu ở các thời gian khác nhau để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. Kết quả cho thấy, ở 24 giờ hoạt tính đạt 1,96 U/ml. Hoạt tính enzyme đạt tối đa ở 120 giờ (2,34 U/ml). Sau
120 giờ hoạt tính giảm dần và trở về mức ổn định, hoạt tính đạt 1,75 U/ml sau 156 giờ nuôi cấy (Hình 3.4 và Bảng 4.3). Nhƣ vậy, thời gian thích hợp nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase là 120 giờ.
160 120 80 40 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168
Thời gian (giờ)
Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trên thế giới. 120 giờ cũng là thời gian để chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase cao nhất (Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani,
2008). Nhƣng cũng ở chủng A. niger, cellulase tạo ra nhiều nhất sau 96 giờ (Acharya et al., 2008). CMCase đƣợc tạo ra từ 3 chủng Trichoderma harzianam, Phanerochaete chrysosporium và Trichoderma spp cao nhất sau 4 ngày lên men với hoạt tính lần lƣợt là 1,88; 2,4 và 1,53 U/ml (Khan et al., 2007). Ojumu và cs (2003) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp glucanase ở chủng A. flavus cho thấy hàm lƣợng cellulase tạo ra cao nhất sau 12 giờ lên men. Nhƣ vậy, các chủng khác nhau thì thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase là khác nhau.
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
Cơ chất cảm ứng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tƣơng ứng. Khi sử dụng CMC vào môi trƣờng nuôi cấy sẽ tác động mạnh đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045. Chủng A. oryzae VTCC-F-045 nuôi trong môi
H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 ,
trƣờng MTK pH 6,5 ở 30°C và bổ sung CMC ở các nồng độ khác nhau, lắc 200 vòng/phút sau 120 giờ. Kết quả cho thấy ở các nồng độ 0,7; 1,0 và 1,5% hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tăng cao hơn so với đối chứng (ở 0,5%), tăng cao nhất ở nồng độ 1,0% (tăng 32%) và hoạt tính enzyme đạt 11,27 U/ml. Các nồng độ CMC còn lại, hoạt tính enzyme giảm tuyến tính so với đối chứng, giảm mạnh nhất ở nồng độ 2,7% (giảm 57%) và đạt 3,66 U/ml (Hình 3.5 và Bảng 4.4). 160 120 80 40 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Nồng độ CMC (%)
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Cao Cƣờng và Nguyễn Đức Lƣợng (2003) khi sử dụng CMC, bột cellulose hay chitinaza vách tế bào nấm làm cơ chất cảm ứng, chúng đều có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp cellulase cao; trong đó cao nhất là CMC. Nhƣ vậy, với nồng độ 1% CMC enzyme đƣợc cảm ứng sinh ra đủ để thủy phân các cao phân tử trong môi trƣờng và cơ chất cho sự sinh trƣởng của tế bào.
3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 nuôi trong môi trƣờng MTK pH 6,5 bổ sung 1% CMC ở 30°C, cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác
H o ạ t t í n h e n d o - β - 1
và môi trƣờng có nguồn cao nấm men làm đối chứng, lắc 200 vòng/phút. Sau
120 giờ nuôi cấy, khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng nghiên cứu
trong môi trƣờng có nguồn carbon là lactose và glucose cao hơn đối chứng, hoạt tính đạt 11,81 U/ml và 2,61 U/ml. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh ra trong môi trƣờng có lõi ngô, vỏ quýt giảm không đáng kể so với nguồn cao nấm men, hoạt tính đạt 2,29 U/ml (lõi ngô) và 1,93 U/ml (vỏ quýt) (Bảng 3.3 và Bảng 4.5). Nhƣ vậy, lactose là nguồn carbon tốt nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Tuy
nhiên, lõi ngô là nguyên liệu dễ kiếm, nên có thể sử dụng cho lên men lƣợng lớn sau này.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Hoạt tính
Nguồn carbon U/ml %
Bã mía 0,82 35 Cao nấm men 2,32 100 CMC 2,11 91 Glucose 2,61 112 Lactose 11,81 508 Lõi ngô 2,29 99 Sucrose 1,93 83 Trấu cám 1,09 47 Vỏ cà phê 1,62 70 Vỏ lạc 1,01 43 Vỏ quýt 2,10 90
Acharya và cs (2008) nhận thấy, chủng nấm A. niger sinh cellulase mạnh nhất trong môi trƣờng có nguồn carbon là mùn cƣa, hoạt tính đạt 0,18
U/ml. Ở chủng A. flavus NSPR 101 mùn cƣa cũng là nguồn carbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase (0,074 U/ml) (Ojumu et al., 2003).
Trong khi đó 3 chủng Trichoderma longi, A. niger và Saccheromyces
cerevisae khi sử dụng nguồn carbon là vỏ quýt rất thích hợp cho quá trình sinh cellulase (Omojasola and Jilani, 2008). Hoàng Quốc Khánh và cs (2003) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase ở chủng A. niger NRRL-363
cho thấy môi trƣờng chứa nguồn carbon trấu xay và rỉ mật đƣờng rất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase. Ở các chủng xạ khuẩn phân lập từ vỏ cà phê, nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh tổng hợp cellulase là bột cellulose và CMC (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Chellapandi và cs (2008) khi nghiên cứu quá trình tổng hợp endoglucanase ở chủng Streptomyces sp
BRC1 và BRC2 cho thấy nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endoglucanase lần lƣợt là glucose và cellobiose. Từ các số liệu thu đƣợc cũng nhƣ tham khảo các tài liệu trong nƣớc và trên thế giới, chúng tôi nhận thấy các chủng khác nhau sẽ thích hợp với nguồn carbon tối ƣu là khác nhau để sinh tổng hợp enzyme tốt nhất.
3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon
Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon là lactose có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất trong số các nguồn carbon đƣợc khảo sát, lactose đƣợc đƣa vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau từ
0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính endo-β-1,4- glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 đạt cao nhất (15,47 U/ml) ở nồng độ 0,4% lactose, cao gấp 3,64 lần so với đối chứng ở 0,1%. Còn ở nồng độ
0,8% lactose, hoạt tính giảm mạnh nhất, giảm tới 51% so với đối chứng (Hình
3.6 và Bảng 4.6). Nhƣ vậy, với nồng độ 0,4 % lactose endo-β-1,4-glucanase đƣợc cảm ứng sinh tổng hợp cao nhất để phân hủy nguồn carbon dinh dƣỡng cho sự sinh trƣởng của tế bào.
400 300 200 100 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 Nồng độ lactose (%)
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK bổ sung 1% CMC và 0,4% lactose ở 30°C, lắc 200 vòng/phút sau 120 giờ, nguồn peptone đƣợc thay bằng các nguồn nitrogen khác. Kết quả cho thấy khả năng tổng hợp endo-β-1,4-glucanase trong môi trƣờng chứa bột đậu tƣơng tăng 89% so với peptone, còn nguồn nitrogen là NaNO3 và bột cá giảm khá nhiều so với peptone, giảm tới 50-59%. Ở nguồn nitrogen bột đậu tƣơng hoạt tính đạt 12,92
U/ml (Hình 3.7 và Bảng 4.7). Nhƣ vậy, bột đậu tƣơng đƣợc chọn làm nguồn
nitrogen trong quá trình nuôi thu enzyme. Đây là nguồn nitrogen tốt và dễ kiếm nên thuận tiện cho việc lên men lƣợng lớn sau này.
Những nghiên cứu ở chủng A. niger cho thấy, khi sử dụng nguồn nitrogen
là peptone, ammonium sulfate, urea đều thích hợp cho quá trình sinh cellulase và
ammonium sulfate làm tăng khả năng sinh cellulase cao nhất (Acharya et al., H o ạ t t í n h e n d o - β - 1
2008). Trong khi đó, urea và bột đậu tƣơng lại là nguồn nitrogen thích hợp nhất cho quá trình sinh cellulase ở chủng A. niger (Hoàng Quốc Khánh et al.,
2003, Narasimha et al., 2006). Đối với các chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập từ
phê, sinh tổng hợp mạnh nhất trong môi trƣờng có nguồn nitrogen là KNO
3
(Lê
Thị Thanh Xuân et al., 2005). Tăng Thị Chính và cs (1999) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt nhận thấy nguồn nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơng) rất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen tốt nhất cho chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006). 200 150 100 50 0 PT NO3 Ure NH4 BC BĐT Nguồn nitrogen
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
PT: pepton, NO3: NaNO3, NH4: (NH4)2SO4, BC: bột cá, BĐT: bột đậu tƣơng
3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen
Sau khi xác định đƣợc nguồn nitrogen là bột đậu tƣơng có khả năng cảm ứng sinh endo-β-1,4-glucanase cao nhất trong số các nguồn nitrogen đƣợc khảo sát, bột đậu tƣơng đƣợc đƣa vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2%. Sau 120 giờ nuôi cấy, endo-β-1,4- glucanase đƣợc chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp cao nhất
H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 ,
(16,39 U/ml) ở nồng độ bột đậu tƣơng 1% cao hơn so 38% so với đối chứng. Bột đậu tƣơng ở
các nồng độ còn lại đều làm giảm sinh tổng hợp enzyme so với đối chứng,
giảm mạnh nhất ở nồng độ 0,5% (giảm 58%) (Hình 3.8 và Bảng 4.8). Bột đậu tƣơng nồng độ 1% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo- β-1,4- glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045. 150 100 50 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Nồng độ bột đậu tương (%)
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau
28, 30 và 37°C trong môi trƣờng khoáng MTK có 0,4% lactose; 1% bột đậu tƣơng, lắc 200 vòng/phút, ở pH 6,5. Sau 120 giờ, nuôi cấy sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đạt cao nhất (14,23 U/ml) ở nhiệt độ 28°C và giảm dần khi tăng nhiệt độ lên 30°C và 37°C. Giảm nhiều nhất ở nhiệt độ 37°C, hoạt tính đạt 5,86 U/ml (Hình 3.9 và Bảng 4.9). H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 ,
120 80 40 0 28 30 37 Nhiệt độ
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Những nghiên cứu ở chủng A. niger cho thấy, cellulase đƣợc tạo ra nhiều nhất ở 28°C (Narasimha et al., 2006, Acharya et al., 2008) và 50°C thích hợp cho chủng A. niger NRRL-363 sinh tổng hợp cellulase (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Ba chủng Trichoderma longi, A. niger và
Saccheromyces cerevisae có nhiệt độ tối ƣu là 45°C (Omojasola and Jilani, 2008). Các chủng nấm sợi ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở nhiệt độ
31-34°C (Đặng Minh Hằng, 1999). Trong khi đó nhiệt độ tối ƣu cho chủng Penicilium sp. DQT-HK1 là 30°C (Trịnh Đình Khá, 2006). Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 28°C thích hợp để chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase.
3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong MTK có 0,4% lactose và 1% bột đậu tƣơng, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28°C và ở các pH khác nhau. Sau 120 giờ nuôi cấy, khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-
H o ạ t t í n h e n d o - β - 1 ,
glucanase đạt cao nhất ở pH 5,5 (100%) là 35,7 U/ml. Ở dải pH 4,0-6,5, chủng A. oryzae
VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase tƣơng đối ổn định từ 34,12-31,48 U/ml đạt 86-88% so với pH tối ƣu 5,5. Ở pH 7,0 endo-β-1,4- glucanase đƣợc tổng hợp thấp nhất (10,37 U/ml) giảm 71 % so với ở pH 5,5 (Hình 3.10 và Bảng 4.10). 120 80 40 0 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH môi trường
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045
Nhƣ vậy, chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase mạnh trong điều kiện pH môi trƣờng ban đầu nghiêng về phía acid. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, các chủng Aspergillus thích hợp trong khoảng pH 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani, 2008). Trong khi, pH môi trƣờng 5,5 lại thích hợp cho chủng A. niger NRRL-363 sinh cellulase (Hoàng Quốc Khánh et al.,
2003).
3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase
Để tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase, 40 ml dịch nổi sau khi nuôi cấy đƣợc tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và giữ ở 4°C qua đêm. Tủa thu đƣợc hòa với 0,1 M đệm acetate pH 5,0 và thẩm tích loại muối. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase riêng của dịch tủa sau loại muối đạt 24,46 U/mg protein và độ sạch enzyme đạt 1,6 lần so với dịch thô ban đầu.
H o ạ t t í n h e n d o - β - 1
Dịch tủa sau khi loại muối cho qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100 với thể tích 10 ml, tốc độ dòng chảy là 25 ml/h. Thu thể tích mỗi phân đoạn
2 ml (thu 20 phân đoạn). Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (Hình 3.11A) cho thấy, protein đƣợc phân tách thành 2 peak, trong đó peak ở phân đoạn 10 cao nhất. Hoạt tính riêng của peak 10 đạt 40,36 U/mg protein. Các phân đoạn có hoạt tính cao đƣợc điện di trên gel 12,5% polyacrylamide với chất chỉ thị phân tử. Điện di đồ hình 3.11B cho thấy, peak 10 xuất hiện một băng đậm, có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa. Chứng tỏ, enzyme thu đƣợc khá sạch với độ sạch 2,6 lần so với dịch enzyme thô ban đầu (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase
từ chủng A. oryzae VTCC-F-045
Bƣớc tinh sạch
Protein tổng Hoạt tính enzyme Độ tinh Hiệu suất thu
số (mg/ml) U/ml U/mg sạch (Lần) hồi (%)
Dịch thô 0,213 3,31 15,54 1,0 100 Tủa (NH4)2SO4 0,074 1,81 24,46 1,6 55 Sephadex G-100 0,028 1,13 40,36 2,6 34 400 300 U/mg mg/ml kDa 116 0.2 66 200 100 0.1 45 36 kDa 35 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Các phân đoạn 0.0 A B 1 2 3 4 5 6
Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A)
Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B)
H oạ t tín h en do - β- 1, 4- gl uc an 0 H à m l ư ợ n g p r 2
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả
nghiên cứu trên thế giới. Hong và cs (2001) khi tinh sạch endo-β-1,4- glucanase tái tổ hợp (Eng1) ở nấm men sau hai bƣớc tinh sạch: tủa ammonium sulfate (60-100%) và đƣa qua cột DEAE-sephadex A-50 đã thu đƣợc Eng1 có độ sạch 1,73 lần so với dịch enzyme thô, khối lƣợng phân tử khoảng 37 kDa. Endo-β-1,4-glucanase (gồm Cel-1 và Cel-3) từ chủng A. oryzae có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 62 và 34 kDa (Fukuda
et al.,
2002); Kitamoto và cs (1996) đã tinh sạch endo-β-1,4-glucanase (gồm CelA và Cel B) từ chủng A. oryzae KBN616 sau khi qua cột DEAE (CelA) và SE-sephadex C50 có khối lƣợng lần lƣợt là 31 kDa và 53 kDa. Endo-β-1,4- glucanase (eng1) từ chủng Trametes hirsuta có khối lƣợng khoảng 40,6 kDa
(Nozaki et al., 2007).
3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu