Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY
1.5.1. Sự thống khí và nồng độ khí CO2 và O2
Nồng độ CO2 cao có nhiều tác động có lợi lên sự kéo dài chồi và sự phát triển của lá dựa trên sự tháo gỡ của chồi ngủ và đốt cây Theobroma cacao, một lồi rất khó nhân giống [38].
Fujiwara và cs (1987) cho rằng, tốc độ quang hợp thấp và sự kém phát triển của cây in vitro là do nồng độ CO2 trong bình ni cấy thấp trong suốt quá trình quang hợp [40]. Nói cách khác, nồng độ CO2 thấp trong bình ni cấy trong hầu hết quang kỳ sẽ ức chế khả năng quang hợp của cây, từ đó buộc cây phải sinh trưởng theo phương thức dị dưỡng hay tự – dị dưỡng nhờ vào sự hấp thu đường từ môi trường như nguồn carbon chủ yếu của cây [60]. Khi cường độ quang hợp của cây in
vitro được gia tăng sẽ làm gia tăng tỷ lệ sống sót của cây in vitro khi đưa ra ngoài
vườn ươm. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng cây trồng chứa diệp lục có khả năng quang hợp tăng khi nuôi cấy trên môi trường chứa CO2 [60].
Bình ni cấy được thiết kế để ngăn chặn vi khuẩn nhưng hạn chế sự trao đổi khí giữa bên trong và bên ngồi bình ni cấy, từ đó ảnh hưởng đến thành phần các khí bên trong bình ni cấy. Thơng thường, việc đậy kín bình ni cấy ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thốt hơi nước q mức từ mơi trường và mẫu cấy. Cũng giống như ánh sáng, sự tích lũy các khí và hơi nước quá mức ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy như sự kéo dài chồi, sự nảy chồi và khối lượng tươi của chồi.
Một hệ thống bình ni cấy kín nhưng được làm thơng thống để giảm hiện tượng thủy tinh thể và nâng cao sự sinh trưởng của cây dâu tây [64]. Nói tóm lại, việc tăng cường trao đổi khí giữa các bình ni cấy và mơi trường bên ngồi nhằm tăng hàm lượng CO2 ở mức tối ưu trong bình ni cấy nhằm tăng cường quang hợp của cây in vitro, giảm hàm lượng O2 trong bình ni cấy xuống khoảng 10% [122].
Trong điều kiện ni cấy thống khí, cây có khả năng hình thành rễ thứ cấp ngay trong giai đoạn in vitro, điều này cải thiện tỷ lệ sống sót của cây khi đưa ra giai đoạn vườn ươm. Việc cải thiện chế độ thống khí trong bình ni cấy có thể đạt được thơng qua việc sử dụng màng lọc thống khí được gắn lên các lỗ của bình để ngăn bụi, vi khuẩn và nhờ sự khuếch tán mà CO2 từ bên ngoài sẽ di chuyển vào bên trong các hệ thống ni cấy, thành phần khí trong bình sẽ dần thay đổi bằng với thành phần khí bên ngồi bình [10].
1.5.2. Thành phần và thể tích mơi trường
Trong ni cấy mô, mơi trường thường được sử dụng với thể tích nhỏ hơn so với mơi trường sử dụng trong thủy canh và các hệ thống sản xuất khác.
Kozai và cs (1991) đã tiến hành nghiên cứu sự thay đổi trong thành phần dinh dưỡng của môi trường theo thời gian dưới những điều kiện quang tự dưỡng và quang dị dưỡng [63]. Chỉ có một vài số liệu hạn chế cho rằng thể tích mơi trường ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của cây nuôi cấy trong điều kiện dị dưỡng và không ảnh hưởng đến cây nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng [52].
1.5.3. Giá thể
1.5.3.1. Định nghĩa
Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu được sử dụng làm vật nâng đỡ, tạo môi trường cho rễ phát triển và bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển. Vật liệu làm giá thể không chỉ đơn thuần là chắc chắn mà cịn có đặc tính ổn định trong mọi điều kiện để có khả năng nâng đỡ, trao đổi khí,… Bên cạnh đó, trong mơi trường in vitro, yếu tố vô trùng là rất quan trọng, quyết định đến sự thành bại của quy trình, nên vật liệu làm giá thể phải chịu được nhiệt độ cao trong quá trình hấp và khơng bị biến tính. Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại giá thể được sử dụng trong nuôi cấy. Mỗi loại đều có ưu thế và hạn chế nhất định nên chỉ phù hợp cho một vài đối tượng và mục đích sử dụng chuyên biệt [96].
1.5.3.2. Agar và một số loại giá thể
Agar là loại giá thể thường được sử dụng phổ biến trong ni cấy mơ. Agar có phổ hoạt động rộng và thích hợp với hầu hết các quy trình nhân giống in vitro như:
kích thích hình thành và nhân chồi, cảm ứng và tạo mô sẹo, phát triển phôi, thực hiện chuyển gene,… cho đến nay, mặc dù có rất nhiều loại giá thể khác với những ưu điểm mới nhưng agar vẫn được sử dụng phổ biến hơn hết [94].
Qua quá trình sử dụng, giá thể agar vẫn cịn nhiều hạn chế, có tác động trực tiếp đến chất lượng cây giống. Do cấu trúc agar có độ thống khí thấp nên rễ phát triển khơng tốt trong in vitro và tỷ lệ sống sót khơng cao khi đưa ra ngồi vườn. Hơn nữa, lực khuếch tán của cation trong mơi trường có agar thấp nên mẫu cấy chỉ có thể sử dụng một phần nhỏ chất dinh dưỡng đưa vào mơi trường. Trong q trình khắc phục những hạn chế của agar, một số loại giá thể khác được đưa vào thay thế như: rookwool, oasis, gelatin, aginate, phytagel,… [99].
Rookwool là loại giá thể có độ thống khí cao. Trước đây, rookwool được sử dụng làm giá thể gieo hạt. Sau đó được cải tiến và đưa vào ứng dụng trên in vitro và chứng minh được một số ưu điểm đối với quá trình nhân giống của một số đối tượng nhất định. Chồi của cây dâu tây phát triển tốt hơn trên giá thể rookwool có bổ sung 100 ml mơi trường MS lỏng dưới đèn đơn sắc so với những giá thể khác [89].
Tuy nhiên, những giá thể mới này thì khơng phổ biến và giá thành tương đối cao. Vì vậy, việc tìm kiếm một giá thể mới rẻ, phổ biến và hiệu quả cao là một việc làm cần thiết.
1.5.3.3. Giá thể film nylon
Neoflon đã được sử dụng để thiết kế hệ thống ni cấy [123]. Neoflon là polymer có tính bền vững nhất về mặt hóa học, đặc biệt là bền với nhiệt, trơ về mặt hóa học đối với hydrocarbon, ethylene glycon…, có nhiệt độ nóng chảy từ 265 – 310°C; do đó, chúng có thể được khử trùng trong nồi áp suất ở nhiệt độ cao nhưng vẫn an toàn. Khả năng truyền khí (O2, N2 và CO2) của loại film này tốt hơn so với
các loại film khác. Chúng có khả năng bay hơi nước thấp và độ truyền suốt cao giống như thủy tinh. Nhờ các đặc tính trên mà người ta đã sử dụng loại film này trong các hệ thống nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên, giá thành của hệ thống này cịn cao, do đó, khó có thể ứng dụng vào ni cấy mơ thực vật ở qui mô công nghiệp.
Polyethylene (PE) là một trong những polymer ổn định, trơ về mặt hóa học (đặc biệt đối với các chất hóa học có tính kiềm, các dung dịch lỏng, các chất acid có tính oxi hóa và tính chất này thể hiện kém hơn đối với acid đậm đặc có tính oxi hóa). Nhựt và cs (2005a) đã ứng dụng thành cơng hệ thống ni cấy film nylon có bản chất là PE trên một số đối tượng cây trồng [86]. Quan sát hình thái khí khẩu và chuyển ra vườn ươm những cây có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy cải tiến này cho thấy cây ít có bất thường về sinh lý và tỷ lệ sống sót cao hơn so với hệ thống nuôi cấy truyền thống [8 – 9], [88], [91], [92].
Film nylon (PE) là một vật liệu rẻ và phổ biến trên thế giới. Nó có độ dẻo để có thể làm thành nhiều hình dáng khác nhau và có thể vận chuyển dễ dàng. Trong những nghiên cứu trước, bao nylon không chỉ được dùng như là túi chứa (có dạng túi), mà còn được dùng làm giá thể trong hệ thống vi thủy canh và thủy canh [87], [89].
Năm 2010, Huy và cs đã ứng dụng hệ thống nuôi cấy túi nylon dạng hộp trong nhân giống cây African violet và cây hoa cúc [3]. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở hệ thống túi nylon dạng hộp, cây African violet sinh trưởng và phát triển rất tốt, đặc biệt số chồi tạo thành cao. Cây hoa cúc nuôi cấy trong hệ thống túi nylon dạng hộp khi chuyển ra điều kiện ex vitro có tỷ lệ sống sót là 100% (đối chứng là 91%). Như vậy, hệ thống ni cấy túi nylon dạng hộp có thể thay thế các hệ thống ni cấy truyền thống (bình thủy tinh) trong nhân giống thực vật hiện nay ở nước ta. Tuy nhiên, loại film nylon cũng có nhược điểm là mềm; do đó, nó rất khó tạo hình khối (hình trụ trịn) để làm giá thể vi thủy canh. Vì vậy, u cầu đặt ra là có loại vật liệu vẫn đảm bảo tính trong suốt, độ dày vừa phải, nhẹ, trơ về mặt hóa học và dễ dàng tạo hình khối theo mục đích.
Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng giá thể film nylon là các bìa kiếng (sử dụng trong văn phịng phẩm) để tạo giá thể cho cây hoa cúc trong hệ thống vi thủy canh nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất, tái sử dụng nhiều lần, dễ dàng vận chuyển. Đây là loại vật liệu dễ mua trên thị trường, giá thành thấp, đảm bảo các tiêu chí cần thiết của giá thể như trong suốt, độ dày vừa phải, trơ về mặt hóa học, có thể chịu nhiệt ở mức nhất định và dễ dàng tạo hình.