Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.7. HỆ THỐNG CHIẾU SÁNG ĐƠN SẮC
1.7.1. Hệ thống chiếu sáng đơn sắc trong nhân giống vơ tính thực vật
Ngồi việc được sử dụng rộng rãi trong các thiết bị, hệ thống chiếu sáng đơn sắc (Light emitting diode – LED) cũng được ứng dụng trong các nghiên cứu nông nghiệp [28], [50], [101]. Việc sử dụng đi-ốt phát quang như một nguồn bức xạ cho thực vật được đặc biệt chú trọng trong những năm gần đây do tiềm năng của nó trong ứng dụng thương mại rất lớn. Hệ thống bức xạ LED tồn phần có một số lợi điểm vượt trội so với những hệ thống chiếu sáng hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô [12]. Sự phát sáng cực đại của LED đỏ và xanh với độ dài sóng thích hợp tạo hiệu quả quang hợp tối đa [74]. LED là nguồn sáng có tuổi thọ dài, dễ thay đổi do đó góp phần giảm chi phí cho thí nghiệm.
LED sinh nhiệt ít do đó giảm thiểu nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh trong việc tạo điều kiện thuận lợi cho nhân giống vơ tính thương mại với chi phí hiệu quả. Do có độ dài sóng đặc biệt và phổ hẹp nên gần đây LED được dùng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu quang sinh học như tổng hợp chlorophyll [129], quang hợp [126] và phát sinh hình thái [50].
LED đỏ có thể được ứng dụng cho thực tiễn vi nhân giống do sự phát photon cao cũng như giá thành thấp khi so sánh đèn với LED có màu khác. Sự kết hợp giữa
các đèn LED có màu sắc khác nhau có thể tạo ra ánh sáng thích hợp cho q trình quang hợp.
Đèn LED có thể kiểm sốt được bức xạ phát ra và khắc phục được hầu hết những nhược điểm của một nguồn sáng thông thường nên là nguồn sáng đầy hứa hẹn để thay thế những thiết bị chiếu sáng truyền thống hiện nay trong nuôi cấy thực vật.
Với những tiện ích trên, đèn LED ngày càng được sử dụng sâu rộng vào ngành nông nghiệp, đặc biệt là trong vi nhân giống.
1.7.2. Vai trò của ánh sáng đơn sắc trong nghiên cứu sự tái sinh, sinh trưởng vàphát triển của thực vật phát triển của thực vật
LED có những đặc tính tốt hơn so với các nguồn sáng khác như: đèn huỳnh quang, đèn halogen kim loại, đèn natri cao áp. Bước sóng của nó phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng hợp chlorophyll [129], quang hợp [126] và phát sinh hình thái [50]. Một vài loại cây trồng thành công dưới hệ thống LED, những cây này bao gồm: tiêu, dưa, lúa mì, bó xơi [28], [50]. Hơn thế nữa, trong tất cả những nghiên cứu này, các đối tượng được trồng dưới hệ thống LED có bổ sung ánh sáng màu xanh và hồng ngoại có nguồn gốc từ đèn hơi kim loại phổ rộng và đèn huỳnh quang xanh, vì khơng có đèn LED xanh có cường độ photon cao. Đây là một trở ngại trong việc sử dụng LED.
Toàn bộ hệ thống phát sáng cho cây trồng đòi hỏi đèn LED phải phát ra cường độ photon cao trong vùng ánh sáng đỏ và xanh đặc biệt. Trước đây, đèn LED xanh chỉ phát ra được cường độ photon thấp và có giá thành cao [28]. Hiện tại cơng ty hóa chất Nichia (Nhật Bản) đã sản xuất và lần đầu tiên trên thế giới tạo ra ánh sáng xanh có cường độ chiếu sáng lớn. Sáng chế này đã mở đường cho sự phát triển cho toàn bộ hệ thống phát sáng LED.
Đèn LED xanh siêu sáng mới có khả năng đánh giá hiệu quả của toàn bộ hệ thống đèn LED (bao gồm cả LED xanh và đỏ siêu sáng) lên sự tăng trưởng cây con
in vitro. Hệ thống mới này khác hẳn với các hệ thống sử dụng đèn LED có bổ sung
ánh sáng xanh từ các nguồn sáng khác đã được công bố trước đây [28], [50]. Hahn và cs (2000) đã báo cáo rằng tốc độ quang hợp của cây Rehmannia glutinose nuôi cấy in vitro là rất thấp dưới hệ thống LED xanh hoặc LED đỏ, trong khi đó, dưới hệ thống LED hỗn hợp (50% LED đỏ và 50% LED xanh) hoặc dưới đèn huỳnh quang có tốc độ quang hợp rất cao [48]. Cường độ photon cao của LED xanh, đỏ và độ dài bước sóng đặc trưng của chúng làm cho hệ thống đèn mới này mang lại nhiều thuận lợi. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống LED, các nhà nghiên cứu đều cố gắng tìm mối quan hệ giữa tỷ lệ ánh sáng xanh và đỏ nhằm chọn lựa vùng quang phổ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tốt cho cây trồng. Trong nghiên cứu của Nhut (2002) cho thấy, cây Eucalyptus citriodora, Phalaenopsis, chuối (Musa spp.) và Spathiphyllum sinh trưởng tốt dưới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 20% LED xanh [89]. Lian và cs (2002) đã nghiên cứu sự phát sinh hình thái và sinh trưởng của vảy củ Lilium với nguồn chiếu sáng đèn LED đỏ, LED xanh và LED đỏ kết hợp với LED xanh [67]. Nhut và cs (2002) cũng đã chứng minh được cây dâu tây in vitro phát triển tốt nhất khi được nuôi cấy với nguồn chiếu sáng đèn LED (70% ánh sáng LED đỏ + 30% ánh sáng LED xanh) với cường độ chiếu sáng là 60 µmol.m-2.s-1 [90]. Jao và cs (2005) nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED lên sự sinh trưởng và hình thành thân của cây Zantedeschia [53]. Trong nghiên cứu của Heo và cs (2006) cũng cho thấy với nguồn chiếu sáng đèn LED, cây nho tăng khả năng sinh trưởng và tổng hợp carbohydrate [49].
Một số nghiên cứu đã sử dụng các cây có giá trị kinh tế để nghiên cứu sinh trưởng và phát triển dưới nguồn ánh sáng đèn LED như Ageratum (Ageratum
houstonianum Mill. cv. Blue Field), cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.) [49], nho
Hybrid Franc (Vitis riparia × V. vinifera cv.), Ryuukyuuganebu (V. ficifolia var.
ganebu) và Kadainou R-1 (Ryuukyuuganebu × V. vinifera cv.) [98]. Hơn nữa, có
nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng đèn LED phù hợp cho sự phát triển in vitro và ex vitro một số loại cây trồng hơn là đèn huỳnh quang [44], [95].
LED được ứng dụng trong nghiên cứu về vi nhân giống trên thế giới; tuy nhiên, ở Việt Nam chỉ có một vài nghiên cứu tập trung vào vấn đề này. Nhựt và cs (2002 đến nay) đã ứng dụng thành công hệ thống chiếu sáng LED trên một số loại cây trồng như lily, lan hài, thu hải đường, cúc,… Những cây trồng nuôi cấy dưới hệ thống đèn LED không những sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện in vitro, mà còn ở điều kiện ex vitro [6], [14], [17]. Những nghiên cứu về giải phẫu học, quang hợp cũng chứng minh rằng những cây nuôi cấy dưới hệ thống LED tốt hơn khi so sánh với hệ thống chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang [12].
Biên và cs (2013) đã chỉ ra rằng chồi thu hải đường tái sinh từ lớp mỏng tế bào tốt nhất dưới tỷ lệ 80% LED đỏ kết hợp với 20% LED xanh [2]. Trong khi đó, dưới điều kiện 70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh cho hiệu quả trong quá trình tái sinh chồi từ lá và lớp mỏng tế bào từ thân của cây cúc [5]. Khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo thu được là cao nhất khi các mẫu lá được nuôi cấy dưới ánh sáng xanh và ánh sáng đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50. Q trình tăng sinh mơ sẹo hiệu quả nhất khi các mô sẹo được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng là ánh sáng xanh và ánh sáng đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50. Ánh sáng xanh và ánh sáng đỏ kết hợp với tỷ lệ 50:50 cũng là nguồn sáng thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro, tuy nhiên, kết quả phân tích sắc ký lỏng cao áp cho thấy, các cây được nuôi cấy dưới ánh sáng huỳnh quang cho sự tích lũy saponin là cao nhất [1]. Ngồi những nghiên cứu tái sinh và tích lũy hợp chất thứ cấp, sự sinh trưởng và phát triển dưới ánh sáng LED đỏ và xanh cũng được thực hiện.
Tác động của cường độ và sự thay đổi giai đoạn chiếu sáng khác nhau giữa LED đỏ và LED xanh đến quá trình sinh trưởng, phát triển và tổng hợp chlorophyll a và b của cây cúc in vitro đã được trình bày trong nghiên cứu của Tùng và cs (2016) [20]. Kết quả nghiên cứu này cho thấy, cường độ 60 µmol.m-2.s-1 là thích hợp cho q trình sinh trưởng và phát triển; tuy nhiên, hàm lượng chlorophyll a và b đạt cao nhất ở cường độ 45 µmol.m-2.s-1. Trong khi đó, giai đoạn chiếu sáng thay đổi 1 tuần đầu LED xanh và 1 tuần sau LED đỏ thích hợp cho q trình sinh trưởng
và phát triển của cây cúc in vitro. Cây cúc dưới điều kiện chiếu sáng LED sau khi chuyển sang vườn ươm 4 tuần có tỷ lệ sống sót, sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với cây ở điều kiện chiếu sáng là đèn huỳnh quang.
Gần đây, Nam (2016) đã tiến hành nghiên cứu có tính tiên phong về hệ thống đèn LED trong tái sinh, sinh trưởng và phát triển một số loại cây trồng tại Việt Nam [7]. Nghiên cứu này đã xây dựng quy trình nhân giống của bốn loại cây trồng có giá trị kinh tế cao là cúc, dâu tây, lan hồ điệp và sâm Ngọc Linh dưới đèn LED.
Chương 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Nguồn mẫu là các cây hoa cúc trắng (Chrysanthemum morifolium) (Nhật Bản) sạch bệnh được ni cấy từ chồi đỉnh (2,5 cm) có nguồn gốc từ nuôi cấy đốt thân (1 cm) trên môi trường nhân chồi là MS - Murashige, Skoog, 1962 (Phụ lục) [81] có bổ sung 0,2 mg/l BA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar [14].
Hình 2.1. Cây cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat. cv. Jimba) in vitro sạch bệnh.
Vật liệu thực vật là các chồi in vitro 45 ngày tuổi được cấy chuyền nhiều lần, có chiều cao từ 10 - 12 cm (Hình 2.1), tại phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên).
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị và dụng cụ: Cân điện tử, máy cất nước, máy đo pH, nồi hấp vô trùng,
tủ cấy vô trùng, dao cấy, đĩa cấy, panh cấy, kéo, ống nghiệm thủy tinh (đường kính 1,5 cm), bình ni cấy 100 ml và 250 ml, dây thun, nylon, găng tay. Dụng cụ được khử trùng bằng autoclave ở 121°C, 1 atm trong 30 phút. Máy đo hàm lượng diệp lục SPAD-502 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Nhật Bản), tủ sấy Sanyo MOV-112, tủ sấy
Memmert, cân kỹ thuật Prescisa (Nhật Bản), đèn UV hai bước sóng 254 nm và 365 nm.
Hóa chất: Dung dịch nano bạc do Viện Công nghệ Môi trường cung cấp với
các hạt nano bạc có kích thước trung bình ≤ 20 nm với nồng độ của dung dịch là 500 ppm [29]. Agar (Việt Xơ, Cơng ty Phan Trần, Hồ Chí Minh), sucrose (Biên Hòa, Đồng Nai), IBA (Sigma-AldrichTM, INC., MO63178, Mỹ), Acetone với độ tinh khiết ≥ 99,5% (Xilong Chemical Co., Ltd, Trung Quốc).
2.1.3. Thiết bị chiếu sáng
Đèn huỳnh quang với bước sóng 320 - 800 nm và điện áp 220 V được sử dụng trong thí nghiệm có kích thước 1,2 m (FL - 40W/T10) có cơng suất 40W (Cơng ty bóng đèn phích nước Rạng Đơng). Một bóng đèn huỳnh quang được sử dụng để làm nghiệm thức đối chứng và đặt giữa giàn ni cấy khoảng cách từ đèn đến nắp bình là 30 cm. Cường độ chiếu sáng là 45 µmol.m-2.s-1.
LED đỏ (R) với bước sóng 650 - 665 nm, điện áp (2V) (Super Bright LEDs Inc., St. Louis Missouri, USA); cơng suất mỗi bóng LED là 0,1W; điện trở 330 Ω (Cơng ty Cổ phần TQCOM - Hà Nội). Bộ nguồn tạo dòng điện 12V với điện áp 5A (Nguồn AXT 450 - Hãng Golden Field).
LED xanh (B) với bước sóng 450 - 500 nm, điện áp (3 V), điện trở 220 Ω (Công ty Cổ phần TQCOM - Hà Nội) và bộ nguồn tạo dòng điện 12 V với điện áp 5 A (Nguồn AXT 450 - Hãng Golden Field).
LED vàng (Y) với bước sóng 570 - 590 nm (điện áp, điện trở và bộ nguồn tạo dòng điện tương tự LED xanh).
LED xanh lá cây (G) với bước sóng 495 - 570 nm (điện áp, điện trở và bộ nguồn tạo dòng điện tương tự LED xanh).
Tỷ lệ kết hợp của LED đỏ và LED xanh phụ thuộc vào số bóng kết hợp giữa chúng theo phương pháp của Nhut (2002) [89]. Cường độ chiếu sáng của đèn LED (45 µmol.m-2.s-1) được điều chỉnh sao cho cường độ giữa các điều kiện khác nhau là tương đương nhau. Các tỷ lệ kết hợp LED đỏ và LED xanh bao gồm:
10% ánh sáng LED xanh + 90% ánh sáng LED đỏ (10B:90R). 20% ánh sáng LED xanh + 80% ánh sáng LED đỏ (20B:80R). 30% ánh sáng LED xanh + 70% ánh sáng LED đỏ (30B:70R). 40% ánh sáng LED xanh + 60% ánh sáng LED đỏ (40B:60R). 50% ánh sáng LED xanh + 50% ánh sáng LED đỏ (50B:50R). 60% ánh sáng LED xanh + 40% ánh sáng LED đỏ (60B:40R).
2.1.4. Giá thể film nylon
Đặc điểm: Bìa kiếng A4 (kích thước khoảng 20 cm × 30 cm), sản xuất tại Việt
Nam (Flexoffice, Tập đoàn Văn phòng phẩm Thiên Long, Việt Nam). Sử dụng cho văn phịng, đóng bìa sách, tài liệu, hồ sơ,...
Chất lượng: Bìa sáng bóng đạt tiêu chuẩn về chất lượng, quy cách khổ A4, độ
dày 1,5 mm, đóng gói 100 tờ/xấp, trong suốt và không thấm nước.
Bảo quản: Nhiệt độ: 10 - 55ºC, độ ẩm: 55 - 95% và tránh xa nguồn nhiệt.
2.1.5. Hệ thống ni cấy
Hộp nhựa trịn Đại Đồng Tiến (HT) (Cơng ty Đại Đồng Tiến, Việt Nam) có chiều cao 8,5 cm, đường kính miệng 12 cm và đường kính đáy 9 cm. Thành phần là nhựa polypropylene (PP), trong suốt, chịu được nhiệt độ cao hơn 100°C và dung tích 500 ml. Mỗi hộp nhựa tròn chứa 15 ống film nylon (Hình 2.2).
Hộp nhựa hình chữ nhật nhỏ Chí Thành (HCN1) (Cơng ty Tân Chí Thành, Việt Nam) có kích thước đáy 20 cm × 28 cm, kích thước miệng 25 cm × 32 cm và có chiều cao 7,5 cm. Thành phần là nhựa PP, trong suốt, chịu được nhiệt độ cao hơn 100°C và dung tích 5 l. Mỗi hộp nhựa HCN1 chứa 300 film nylon.
Hộp nhựa hình chữ nhật Duy Tân (HCN2) (Cơng ty nhựa Duy Tân, Việt Nam) có chiều cao 16,1 cm, chiều rộng 31,8 cm và chiều dài 45,7 cm. Thành phần là nhựa PP trong suốt, chịu được nhiệt độ từ -20 - 120°C và dung tích 15 l. Mỗi hộp nhựa HCN2 chứa 600 film nylon.
2.1.6. Môi trường ni cấy
Mơi trường in vitro: mơi trường ½MS, khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, pH 5,8 và hấp khử trùng.
Mơi trường vi thủy canh: mơi trường ½MS, khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, pH 5,8 [87] không hấp khử trùng.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU2.2.1. Thiết lập hệ thống vi thủy canh 2.2.1. Thiết lập hệ thống vi thủy canh
Hệ thống vi thủy canh được thiết lập với giá thể film nylon và đưa ra một số thông số của hệ thống vi thủy canh.
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn
Ảnh hưởng của tiền xử lý IBA lên khả năng ra rễ của cây cúc. Ảnh hưởng của thể tích mơi trường lên sự tăng trưởng của cây cúc. Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy lên sự tăng trưởng của cây cúc. Ảnh hưởng của điều kiện thống khí lên sự tăng trưởng của cây cúc.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc lên khả năng kháng khuẩn trong mơi trường vi thủy canh hộp nhựa trịn
Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng tăng trưởng của cây cúc. Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng kháng vi sinh vật.
Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tăng trưởng của cây cúc ở giai đoạn vườn ươm.
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống chiếu sáng LED lên sự gia tăng sinh trưởng cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn
Ảnh hưởng của các loại ánh sáng khác nhau lên sự tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh.
Ảnh hưởng của các loại ánh sáng khác nhau lên khả năng tích lũy chlorophyll trong lá của cây cúc.
Ảnh hưởng của các loại ánh sáng khác nhau lên sự tăng trưởng của cây cúc ở điều kiện vườn ươm.
2.2.5. Đánh giá hiệu quả nhân giống của phương pháp vi thủy canh so với phương pháp nhân giống in vitro
Đánh giá hiệu quả của phương pháp vi thủy canh và phương pháp vi nhân giống cây hoa cúc.
Ảnh hưởng của hệ thống vi thủy canh khác nhau lên sự tăng trưởng của cây cúc.
2.2.6. Trồng thử nghiệm cây cúc trong hệ thống vi thủy canh ra vườn ươm đến giai đoạn ra hoa
Đánh giá khả năng thích nghi và tăng trưởng của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh ra vườn ươm đến giai đoạn ra hoa.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tiền xử lý IBA lên khả năng ra rễ của cây cúc trong hệ thống vi thủy canh hộp nhựa tròn
Các chồi cúc (3 cm) được cắt bỏ phần lá dưới gốc (còn 2 cặp lá), được tiền xử