Biểu đồ 3.12. Chiều cao cây cúc in vitro và vi thủy canh ở giai đoạn vườn ươm.
Các chỉ tiêu theo dõi như số lá, chiều rộng lá, chiều dài lá, số rễ và chiều dài rễ hầu như khơng có sự khác biệt giữa cây vi thủy canh và cây vi nhân giống khi chuyển ra điều kiện vườn ươm.
Bảng 3.12. Các giai đoạn phát triển của cây cúc vi nhân giống và vi thủy canh ở
giai đoạn vườn ươm.
Ra nụ Ngắt nụ Bung nụ Ra hoa 100%
(tuần) (tuần) (tuần) (tuần)
Vi nhân giống 12,91 ± 0,09* 13,94 ± 0,60 15,08 ± 0,56 16,77 ± 0,17
Vi thủy canh 12,11 ± 0,53 13,08 ± 0,06 14,08 ± 0,56 15,97 ± 0,72
Ghi chú: *Các giá trị thể hiện giá trị trung bình ± SE (xử lý LSD).
Những cây cúc trong hệ thống vi thủy canh khi trồng ở điều kiện vườn ươm đều cho ra hoa sớm hơn khoảng 1 tuần so với những cây cúc nhân giống in vitro
(Bảng 3.12). Sau 16 tuần ở điều kiện vườn ươm, tất cả cây cúc nuôi cấy trong hệ thống vi thủy canh đều ra hoa (Hình 3.25).
Hình 3.25. Các giai đoạn của cây hoa cúc nuôi cấy vi thủy canh ở vườn ươm. Bảng 3.13. So sánh khả năng tăng trưởng của cây cúc vi nhân giống và vi thủy canh
ở giai đoạn ra hoa.
Vi nhân giống Vi thủy canh
Chiều cao cây (cm) 76,17 ± 0,68* 86,13 ± 1,00 Số lá/cây 35,33 ± 1,03 37,00 ± 0,71 Chiều dài lá (cm) 8,27 ± 0,09 8,33 ± 0,06 Chiều rộng lá (cm) 6,20 ± 0,03 6,43 ± 0,05 Đường kính thân (mm) 6,67 ± 0,25 7,33 ± 0,25 Số hoa/cây 1,00 ± 0,00 1,00 ± 0,00 Đường kính hoa (cm) 7,27 ± 0,06 8,83 ± 0,02
Kết quả của thí nghiệm này cho thấy, khả năng tăng trưởng của cây cúc vi thủy canh là tối ưu hơn cây vi nhân giống ở giai đoạn ra hoa thể hiện các chỉ tiêu như chiều cao cây (86,13 cm) và đường kính hoa (3,60 cm) khi so sánh với cây cúc không ngắt nụ. Cây cúc nuôi cấy trong hệ thống vi thủy canh cho ra hoa đều và đẹp (Hình 3.26).
Hình 3.26. Hoa của cây cúc ni cấy vi thủy canh sau 16 tuần
ở giai đoạn vườn ươm.
Để có thể áp dụng ở quy mơ thương mại cũng như đưa vào ứng dụng sản xuất, cây cúc nuôi cấy trong hệ thống vi thủy canh (1.000 cây) được trồng thử nghiệm với quy mô lớn ở giai đoạn đồng ruộng. Sau 4 tuần và 8 tuần ở đồng ruộng (Hình 3.27a, b), các cây cúc thích nghi tốt ở đồng ruộng và tăng trưởng nhanh.
Hình 3.27. Cây hoa cúc ni cấy vi thủy canh ở giai đoạn đồng ruộng.
a: 4 tuần; b: 8 tuần; c, d: 12 tuần tuổi; e, f: 14 tuần.
Sau 12 tuần ở đồng ruộng, cây cúc bắt đầu bung nụ (Hình 3.27c, d), kết quả này cũng tương tự với kết quả chúng tơi trồng thí nghiệm ở vườn ươm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Đến tuần thứ 14 cây cúc bắt đầu bung nụ và cho ra hoa (Hình 3.27e, f).
Từ những kết quả của nghiên cứu này, hệ thống nhân giống vi thủy canh với hộp nhựa trịn (15 cây/hộp) và hộp nhựa hình chữ nhật (600 cây/hộp) được đề xuất cho nhân giống cây hoa cúc trắng. Hệ thống này có thể dễ dàng thực hiện với giá thể dễ mua trên thị trường, dễ thực hiện bởi người nơng dân, có thể áp dụng để sản xuất thương mại cũng như hướng tới xuất khẩu cây giống nhằm nâng cao giá trị của
cây giống; qua đó, có thể chủ động được nguồn cung cấp giống sạch bệnh, chất lượng tốt cũng gia gia tăng thu nhập cho người dân.
Đề xuất quy trình nhân giống cây hoa cúc trắng bằng phương pháp vi thủy canh
Dựa trên những kết quả của nghiên cứu này, quy trình nhân giống cây hoa cúc trắng bằng phương pháp vi thủy canh được đề xuất như sau:
Mơ tả quy trình:
(1) Thu nhận chồi in vitro: Các chồi cúc in vitro được cắt lấy phần ngọn có
chiều dài khoảng 3 cm. Phần đốt thân còn lại 7 – 8 cm (khoảng 6 – 7 đốt) được cắt thành các đoạn ngắn khoảng 1 cm (1 đốt) và cấy chuyển sang môi trường nhân chồi.
(2)Tiền xử lý với IBA: Chồi ngọn in vitro (3 cm) được cắt bỏ phần lá dưới gốc
(còn lại 2 cặp lá) và nhúng phần gốc vào dung dịch tiền xử lý ra rễ trong thời gian 20 phút và giữ cho phần ngọn không tiếp xúc với dung dịch tiền xử lý
(3)Thu nhận chồi và thiết lập hệ thống vi thủy canh: Sau 20 phút tiền xử lý
với IBA, những chồi cúc này được rửa lại bằng nước cất và thu nhận chồi. 15 giá thể được đặt vào hộp nhựa tròn và 600 giá thể được đặt vào hệ thống hộp nhựa hình chữ nhật. Bổ sung mơi trường ½ MS vào hộp nhựa nhỏ và hộp nhựa hình chữ nhật với chiều cao mơi trường là 7 mm. Hệ thống vi thủy canh với màng thoáng khí Millipore.
(4, 4’) Đặt chồi cúc vào hệ thống vi thủy canh: Chồi cúc thu nhận sau tiền xử
lý với dung dịch ra rễ được cho vào hệ thống vi thủy canh thiết lập sẵn (15 chồi vào hộp nhựa tròn và 600 chồi vào hộp nhựa hình chữ nhật).
(5) Điều kiện nuôi cấy: Đặt hệ thống vi thủy canh dưới điều kiện chiếu sáng
70% LED đỏ kết hợp với 30% LED xanh với quang kỳ 16 giờ/ngày sau 2 tuần nuôi cấy.
(6)Thu nhận cây giống: Sau 2 tuần có thể chuyển ra trồng tại vườn ươm hoặc
đóng trong các hộp nhựa hoặc để nguyên hệ thống để vận chuyển và xuất khẩu cây giống.
Chương 4BÀN LUẬN BÀN LUẬN 4.1. THIẾT LẬP HỆ THỐNG VI THỦY CANH
Trong nghiên cứu của Nhut và cộng sự (2005b), tác giả đã nghiên cứu mơ hình
vi thủy canh hộp nhựa tròn với giá thể film nylon [87]. Tuy nhiên, nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ đề xuất mơ hình, chưa đưa ra những thơng số cụ thể của hệ thống cũng như phát triển thành các hệ thống lớn hơn nhằm phục vụ sản xuất thương mại.
Trong nghiên cứu này, về giá thể, chúng tơi lựa chọn các film nylon là các bìa kiếng A4 với độ dày lớn hơn (1,5 mm); do đó, khi đặt vào trong hệ thống vi thủy canh và đổ môi trường vào các giá thể không bị nổi lên trên (Nghiên cứu của Nhut và cộng sự (2005b) sử dụng các bao nylon mỏng và nhẹ hơn làm giá thể nên chúng thường bị nổi lên trên mơi trường, rất khó để cố định cây; nếu liên kết chúng lại với nhau bằng các ghim bấm thì chúng dễ bị rỉ sắt sau một thời gian ngập trong môi trường) [87]. Các giá thể dễ dàng bảo quản và sử dụng được nhiều lần hơn.
Ngoài ra, nghiên cứu này chúng tơi sử dụng các màng thống khí trên nắp hộp nhằm làm giảm hiện tượng ứ động hơi nước lên bề mặt nắp hộp, điều này làm cho lá cây dễ bị úng do nước đọng rơi xuống). Việc sử dụng màng thống khí làm cho khơng khí dễ trao đổi với mơi trường bên ngồi hơn, cân bằng độ ẩm khơng khí bên trong hệ thống ni cấy và bên ngồi mơi trường. Bên cạnh đó, các thơng số về nhiệt độ, độ ẩm điều kiện chiếu sáng, nồng độ khí CO2 và O2 được thiết lập theo điều kiện của phịng thí nghiệm và có các thơng số cụ thể.
Các hệ thống vi thủy canh khác nhau (hộp nhựa trịn và hộp nhựa hình chữ nhật) cũng được đề xuất trong nghiên cứu này nhằm đưa ra hệ thống vi thủy canh lớn hơn, giúp sản xuất nhiều cây giống hơn; qua đó, có thể tiết kiệm được chi phí sản xuất cũng như từng bước đưa ra sản xuất thương mại.
4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TÁC ĐỘNG LÊN KHẢ NĂNGTĂNG TRƯỞNG CỦA CHỒI CÚC TRONG HỆ THỐNG VI THỦY CANH TĂNG TRƯỞNG CỦA CHỒI CÚC TRONG HỆ THỐNG VI THỦY CANH HỘP NHỰA TRÒN
4.2.1. Tiền xử lý IBA lên khả năng ra rễ
Auxin có tác dụng kích thích sự hình thành rễ bất định, rút ngắn thời gian ra rễ và làm tăng số lượng cũng như chiều dài rễ [105], nhưng không phải lồi nào cũng có kết quả tương tự [37]. Auxin chỉ cần thiết để phản biệt hóa tế bào và xuất hiện mầm rễ trong giai đoạn đầu của sự hình thành rễ, cơ quan và phơi vơ tính. Vì
ở giai đoạn kéo dài rễ, nó ngăn cản sự phát triển [32]. Điều này giải thích tại sao khi tiền xử lý ra rễ với 500 ppm IBA thì 100% các cây đều ra rễ (Hình 3.1a), trong khi đó bổ sung 500 ppm IBA trực tiếp vào mơi trường ni cấy thì chỉ có 20% các cây ra rễ (Hình 3.1c). Đối với các cây không được tiền xử lý với IBA (xử lý với nước cất), kết quả chúng tôi ghi nhận được là khoảng 60% số cây ra rễ; tuy nhiên, số rễ của các cây này không nhiều và chiều dài rễ ngắn hơn so với cây được tiền xử lý với IBA (Hình 3.1b).
Quá trình hình thành và phát triển rễ là một quá trình phức tạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có sự tương tác của auxin với mẫu cấy [105]. Việc tiền xử lý các chồi cúc với auxin kích thích sự ra rễ, do đó, các chồi cúc đều có số rễ nhiều hơn so với đối chứng là các chồi khơng tiền xử lý với auxin. Thí nghiệm này đã xác định được vai trò của auxin trong việc xử lý ra rễ đoạn cắt.
IBA là một loại auxin tổng hợp được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau để xử lý ra rễ đoạn cắt của một số cây như Citrus auriantifolia [25],
Chromolaena odorata [23]. Môi trường chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu này là
½MS cho tất cả các nghiệm thức (mơi trường MS có nồng độ khống đa lượng giảm đi một nửa) nhằm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ IBA tiền xử lý lên khả năng ra rễ của chồi cúc, chính vì vậy khơng có sự khác biệt về chiều dài lá và chiều rộng lá.
Các cây được tiền xử lý với nước cất và bổ sung IBA trực tiếp vào mơi trường ni cấy có chiều cao cây, khối lượng tươi và khối lượng khơ thấp; điều này có thể là do các cây khơng ra rễ hoặc tỷ lệ ra rễ thấp làm cho khả năng hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường giảm, dẫn đến sự sinh trưởng giảm, một số cây có hiện tượng vàng lá.
Thực vật có 3 kiểu tái sinh: sự hình thành chồi (caulogenesis), sự tạo rễ (rhizogenesis) và sự phát sinh phôi soma (embryogenesis) [33]. Sự phát triển của chồi nách sau khi loại bỏ chồi đỉnh cũng liên quan đến việc thay thế các bộ phận đã mất. Mặc dù ở thực vật, sự tái sinh giới hạn như một quy luật bị giới hạn bởi sự hình thành cơ quan mới (bất định) như chồi, rễ hay phơi từ mơ khơng có mơ phân sinh tồn tại trước đó. Trong 3 loại tái sinh thì rễ gần như là dễ nhất. Trong q trình phát triển tự nhiên, thực vật có thể phát triển rễ bên từ các tế bào và biểu bì rễ trụ. Ở cây 1 lá mầm, rễ ban đầu mọc từ mô phân sinh phôi thường chết đi rất sớm và các mơ phân sinh rễ mới hình thành từ phần gốc của thân, đối với cây 2 lá mầm, rễ bất định có thể hình thành từ thân. Điều này xảy ra thường xuyên trong điều kiện tự nhiên hay một số điều kiện mơi trường nhất định, ví dụ như khi bị ngập một phần [132]. Những tế bào phân sinh thường định vị ở giữa các mô mạch. Trong sự phát triển tự nhiên, tượng tầng thứ cấp bắt nguồn từ các tế bào này đã chứng tỏ các tế bào vẫn chưa biệt hóa đầy đủ.
4.2.2. Thể tích mơi trường ni cấy
Cơ chế của sự thay đổi mơi trường trong bình ni cấy tương tự như trong nhà kính. Một bình ni cấy có thể xem như một nhà kính thu nhỏ hay một phịng sinh trưởng và mẫu cấy được nuôi cấy in vitro cũng tương tự như là nhân giống vơ tính bằng phương pháp giâm cành thu nhỏ. Thực tế cho thấy, môi trường vật lý in vitro
trong nuôi cấy mô truyền thống khác biệt so với những điều kiện trong nhà kính và những cây con với những vấn đề sinh lý và bệnh lý không mong muốn thường được tạo ra. Tuy nhiên, những nghiên cứu vi nhân giống đã bỏ qua những nhân tố môi trường và quan tâm chủ yếu vào những ứng dụng của CĐHST thực vật ngoại sinh.
Môi trường nuôi cấy thường là lỏng hay bán rắn. Chất tạo đông thường được sử dụng nhất là agar. Tuy nhiên, agar ảnh hưởng tới thế nước của chất nền, độ ẩm, nước có sẵn và những chất hịa tan. Trong nghiên cứu này, giá thể chúng tôi sử dụng là các ống làm bằng film nylon, chúng trơ về mặt hóa học, khơng ảnh hưởng tới điều kiện sinh trưởng của cây. Đối với nuôi cấy lỏng, hiện tượng thủy tinh thể được ghi nhận ở một vài lồi thậm chí khi những chồi ni cấy bằng hệ thống máy lắc. Thể tích mơi trường cũng có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của cây. Có sự tương đồng về tốc độ hấp thu ion giữa những cách xử lý khác nhau, tốc độ tiêu hao ion trong một khoảng thời gian sẽ lớn hơn khi thể tích mơi trường ban đầu nhỏ hơn hay hàm lượng ion ban đầu trong bình ni cấy nhỏ hơn. Khi cây khoai tây nuôi cấy in
vitro dưới điều kiện quang tự dưỡng trong 23 ngày trên 16 và 32 ml/bình mơi
trng lng MS, ẵMS, ẳMS trong bỡnh thy tinh, khối lượng tươi, khối lượng khô, chiều dài chồi, số lá, diện tích lá, khối lượng khơ của lá và tốc độ tăng trưởng tương đối trong một ngày của cây đã được nâng cao trong khi đó sự gia tăng phần trăm chất khơ bị ngăn cản với khi gia tăng thể tích [61].
Khi tăng thể tích mơi trường lên 60 – 70 ml (độ sâu mơi trường là 11 – 13 mm) thì các cây khơng ghi nhận được sự ra rễ, các cây bị ngập trong mơi trường nên hình thái của thân và lá bị biến dạng, hầu hết các lá đều bị vàng, thân cịi cọc (Hình 3.3e). Điều này có thể được giải thích là khi mẫu cấy khơng hồn tồn ngập chìm trong mơi trường, chúng có khả năng trao đổi khí cao hơn. Điều này là do sự ngập chìm của mẫu cấy trong môi trường, làm giảm khả năng hô hấp và trao đổi khí giữa mẫu cấy và mơi trường. Khi thiếu oxygen, chu trình TCA khơng thể hoạt động, rễ bắt đầu quá trình glycolysis và lên men lactic. Sự lên men này hạ thấp pH của tế bào kéo theo sự lên men ethanol làm giảm ATP cho các quá trình biến dưỡng cơ bản, quá trình vận chuyển và hoạt động của tế bào. Khi thiếu oxyen, sự vận chuyển hoạt động của H+ vào không bào bị cản, khuynh độ pH bình thường khơng được duy trì, H+ thốt dần ra khỏi khơng bào và tế bào chất, làm tế bào chất bị acid hóa. Sự acid hóa bất thường khơng hồn nghịch này làm cho sự biến dưỡng trong tế bào chất bị gián đoạn, dẫn đến sự chết tế bào [31].
Trong khi đó, khi thể tích mơi trường là 30 ml (độ sâu môi trường 5 mm), sau khoảng 1 tuần nuôi cấy cây cúc bắt đầu ra rễ và hấp thu môi trường; đến tuần thứ 2 mơi trường cịn lại khơng đáng kể. Chính điều này là giảm sự tăng trưởng của cây. Bên cạnh đó, đối với những hộp nhựa trịn (có mặt đáy bị lồi lên) những cây nằm ở vị trí giữa hộp thì sau khoảng 10 ngày ni cấy mơi trường xung quanh những gốc cây đó cạn kiệt; do đó, cây khơng những khơng hâp thu được mơi trường mà chúng có thể bị héo nếu để thời gian lâu hơn và sẽ khó khăn trong vận chuyển cây giống nếu vận chuyển nguyên cả hộp.
Vì vậy, đối với hệ thống vi thủy canh hộp nhựa trịn thì thể tích mơi trường là 40 ml (tương đương độ sâu môi trường là 7 mm) là phù hợp cho sự tăng trưởng của cây cũng như đảm bảo lượng mơi trường cịn lại cho cây tăng trưởng và hạn chế sự héo cây do mơi trường cạn kiệt.
4.2.3. Mật độ mẫu cấy
Có rất ít nghiên cứu nói về mối tương quan giữa mật độ của mẫu cấy và thể tích mơi trường cũng như sự cạnh tranh giữa các mẫu cấy trong môi trường. Mustafa và cs (2011) khi nghiên cứu mẫu cấy trụ dưới lá mầm cây lanh nhận thấy rằng khi tăng mật độ (hay giảm khoảng cách) của mẫu cấy thì sẽ gia tăng số cây,