CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp phân tích mẫu
2.4.1. Phân tích các thơng số hóa lý
Bảng 2. 4. Kỹ thuật phân tích các thơng số hóa lý mẫu nước mặt và trầm tích
Nền mẫu Thơng số hóa lý Kỹ thuật phân tích TLTK
pH, độ dẫn điện
(EC), tổng chất rắn Hydrolab Model (Multi Set 430iWTW)
Nước mặt hòa tan (TDS), nhiệt [77] độ
Độ đục Đĩa Secchi (đường kính 30 cm)
Lắc 10 g trầm tích khơ trong 25 mL nước
pH cất 10 phút. Lắng 10 phút, đo bằng máy [78]
pH điện tử (HI 8424, HANNA Instruments, Sarmeola di Rubano PD, Ý)
Trầm tích Tổng cacbon hữu cơ Máy phân tích tổng cacbon (Multi C/N [79]
(TOC) 3000, Analytik Jena AG, Jena, Đức)
Máy phân tích kích thước hạt laser
Kích thước hạt Microtrac S3500 (Microtrac Inc., [80] Montgomeryville, PA, Hoa Kỳ)
2.4.2. Xác định OCPs trong mẫu nước
Phương pháp chiết lỏng – lỏng được sử dụng để xác định dư lượng OCPs trong các mẫu nước theo quy trình được mơ tả bởi Pandit và cộng sự [81] và được thực hiện tại phịng thí nghiệm Viện Khoa học Công nghệ và Quản lý Môi trường- Trường ĐH Công Nghiệp TP HCM và Trung tâm Kiểm định thuốc bảo vệ thực vật phía Nam, TP HCM. Với 50 mL thể tích n–hexan được đưa vào phễu tách 2 lít chứa 1 lít nước cất và được lắc thủ cơng trong 5 phút và để lắng. Sau khi chiết tách hồn tồn, pha hữu cơ được dẫn lưu vào bình nón 250 mL, trong khi pha nước được chiết lại hai lần với 50 mL n–hexan. Ba pha hữu cơ chiết xuất được kết hợp và sấy khô bằng cách đi qua một phễu thủy tinh chứa natri sulfat khan. Phần hữu cơ được cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không [81].
2.4.3. Xác định OCPs trong mẫu trầm tích
Quy trình xử lý mẫu trầm tích được khảo sát và xây dựng dựa trên sự tham khảo quy trình kỹ thuật của EPA (EPA 608, EPA 8082, EPA 8081b, EPA 1614) và
cơng trình nghiên cứu được cơng bố [27] nhằm phù hợp với điều kiện nghiên cứu hiện tại. Phương pháp chiết Soxhlet được sử dụng rộng rãi hơn để chiết OCPs ra khỏi các đối tượng mẫu do độ thu hồi tốt, hiệu suất chiết cao. Do vậy, trong luận án này, kỹ thuật chiết được lựa chọn là kỹ thuật chiết Soxhlet với dòng dung môi hồi lưu liên tục qua mẫu trong nhiều giờ. Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát một số điều kiện chiết và xử lý mẫu để tối ưu quy trình phân tích tại Phịng thí nghiệm Viện Khoa học Cơng nghệ và Quản lý môi trường – Trường ĐH Công Nghiệp TP HCM; và Trung tâm kiểm định thuốc bảo vệ thực vật phía Nam, TP HCM, quy trình xử lý mẫu trầm tích cho phân tích OCPs được tóm tắt tại sơ đồ Hình 2.3. Theo quy trình này, mẫu trầm tích khơ được chiết Soxhlet với 300 mL hỗn hợp n–Hexan:axeton (1:1) trong thời gian 16 giờ. Dịch chiết sẽ được cô đặc và định mức về 10 mL.
5mL dịch chiết được làm sạch trên cột nhồi florisil đã hoạt hóa (Cột chiết có chiều dài 40 cm và đường kính 2 cm). Q trình rửa giải bằng 120 mL hỗn hợp n- hexan:DCM (4:1) để thu OCPs. Dịch chiết sẽ được cô đặc và rửa loại chất màu và mùn bằng axit (nếu cần). Cuối cùng dịch chiết được cô về 1mL và chuyển vào lọ đựng mẫu, tiến hành phân tích OCPs trên thiết bị GC/ECD.
2.4.4. Xác định OCPs trong mẫu sinh vật
Quy trình xử lý mẫu sinh vật cho phân tích OCPs tương đối giống với quy trình xử lý mẫu trầm tích [27] (Hình 2.3). Tuy nhiên, trong mẫu sinh vật, hàm lượng lipit thường lớn nên quá trình rửa mẫu bằng axit sulfuric đặc được lặp lại nhiều lần hơn (5 lần). Đồng thời, với mẫu sinh vật, không cần thêm phoi đồng để loại bỏ các hợp chất sunfua. Các mẫu cá và nhuyễn thể hai mảnh vỏ được phân tích tại Viện Khoa học Cơng nghệ và Quản lý Môi trường – Trường ĐH Công Nghiệp TP HCM và Phịng thí nghiệm Độc học sinh thái – Trường ĐH Liege, Vương Quốc Bỉ.
2.5. Các phương pháp thử nghiệm trên phơi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương và cá medaka
2.5.1. Phơi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương
2.5.1.1. Chuẩn bị mẫu trầm tích và ấu trùng hàu Thái Bình Dương
Trầm tích tại cửa sơng Sồi Rạp được lấy theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6663-19:2015 (ISO 5667-19:2004) về Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 19: Hướng dẫn lấy mẫu trầm tích biển [82].
Phơi và ấu trùng hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) được ni ở Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ (BR-VT) trong môi trường nước biển nhân tạo, thành phần môi trường pha theo quy trình của BS ISO 17244 Chất lượng nước - Chỉ thị sinh học về độc tính tiềm ẩn trong mơi trường nước - Xác định [83].
2.5.1.2. Bố trí thí nghiệm bổ sung và tách chiết DDT trong trầm tích
Mẫu trầm tích sạch được lấy tại cửa sơng Sồi Rạp có toạ độ 10°25'56,2"N và 106°46'48,1"E, sau khi mang về phịng thí nghiệm được rửa bằng nước biển nhân tạo nhằm loại bỏ bớt một số tạp chất trước khi sử dụng để bổ sung và tách chiết. Các bước bổ sung và tách chiết DDT trong trầm tích được chuẩn bị theo quy trình của Fathallah [84].
DDT được bổ sung vào trầm tích lần lượt với hàm lượng 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 và 5 (mg/kg) tương đương với thể tích DDT 100 ppm bổ sung 2; 10; 20; 50; 200; 1000 (µg/L). Quy trình thực nghiệm thể hiện trong Hình 2.4 dưới đây:
Hình 2. 4. Sơ đồ tổng hợp các bước bổ sung và rửa giải trầm tích2.5.1.3. Phương pháp thực nghiệm sinh học 2.5.1.3. Phương pháp thực nghiệm sinh học
Thử nghiệm sinh học trên phôi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương được tiến hành
đánh giá EC50 nhằm phát hiện ngưỡng 50% cá thể chưa phân bào; và LC50 nhằm phát hiện ngưỡng nồng độ gây tử vong 50% cá thể hàu thử nghiệm.
Thí nghiệm sinh học trên hàu Thái Bình Dương ni ở Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ (BR-VT) được thực hiện theo quy trình của Levertt và Thain [85] tham khảo thêm một số quy trình trước đây trên một số lồi nhuyễn thể hai mảnh vỏ và nhím biển của Chung và cộng sự [86] và Lindsay và cộng sự [87]. Quy trình
Hình 2. 6. Sơ đồ thử nghiệm sinh học trên hàu Thái Bình Dương
2.5.2. Phơi, ấu trùng cá medaka
2.5.2.1. Chuẩn bị cá và phôi cá
Trong phạm vi luận án, cá medaka (O. latipes) được lấy giống từ Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam đã được sử dụng để đánh giá độc tính của DDT đến sự phát triển của phơi cá. Cá medaka được ni duy trì ở điều kiện nhiệt độ 280C ± 100C, pH: 6,5, độ cứng tổng: 13 mgCaCO3/L, độ kiềm tổng: 0,1 (mgCaCO3/L) và chu kì quang là 14 giờ sáng:10 giờ tối. Nước bể nuôi được lọc liên tục để đảm bảo độ sạch. Cá được cho ăn bằng sản phẩm thương mại bán sẵn cho cá cảnh 1-2 lần/ngày và được bổ sung bằng thức ăn tươi là bobo.
Ngừng cho cá ăn trong khoảng nửa ngày trước khi tiến hành ghép đôi để phối cá. Sau đó, tạo một vách ngăn giữa bể phối để tách riêng cá đực và cá cái theo tỉ lệ 1: 1 vào cuối chu kì sáng và tháo vách ngăn để cá phối với nhau.
Sau 30 phút cho phối, tồn bộ phơi được thu sang cốc thủy tinh 1000 ml và tiến hành loại bỏ các phôi không được thụ tinh. Các phôi tốt được thu nhận vào các đĩa petri thủy tinh sạch có đường kính 35 mm để ni phơi.
2.5.2.2. Bố trí thí nghiệm bổ sung DDT
Quy trình thí nghiệm của luận án được xây dựng theo hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất trên phơi cá của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (OECD 236 công bố ngày 26/7/2013). Nồng độ gốc của DDT là 1235ppm (p = 97,8%) được pha lỗng trong dung mơi hữu cơ DMSO (dimethyl sulfoxide) 0,1%.
Chọn những phơi khỏe mạnh (những phơi có cấu trúc trong suốt, màng phơi cịn ngun vẹn, khối nỗn hồng đặc đều) chuyển vào giếng thí nghiệm theo các nồng độ tương ứng của DDT là: 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,2; 0,24; 0,28 µg/L và đối chứng (0 µg/L). Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần, mỗi giếng có 10 phơi/nồng độ.
2.5.2.3. Phương pháp thực nghiệm sinh học
Thử nghiệm sinh học trên phôi, ấu trùng cá medaka được tiến hành đánh giá LC50 nhằm phát hiện ngưỡng nồng độ DDT gây tử vong 50% phôi cá; quan sát những thay đổi hình thái phơi, cá medaka sau khi phơi nhiễm nhằm xác định mức độ ảnh hưởng của hóa chất và phân tích biểu hiện gen của phơi cá thử nghiệm. Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng Thủy sản Trung tâm sinh học TP HCM. Quy trình thí nghiệm được thể hiện theo sơ đồ dưới đây (Hình 2.7):
2.6. Các phương pháp đánh giá độc tính
2.6.1. Xác định LC50, EC50 và tỷ lệ sống chết
Tỷ lệ phôi, ấu trùng hàu và cá tử vong thực tế của các nồng độ thử nghiệm sau 24, 48, 72 và 96 giờ thí nghiệm được tính theo cơng thức Abbott và WHO như sau:
Tỷ lệ tử vong thực tế = (tỷ lệ sống mẫu đối chứng−tỷ lệ sống mẫu thử nghiệm)×100 tỷ lệ sống mẫu đối chứng
Hồi quy Probit, cịn được gọi là mơ hình probit, được sử dụng để mơ hình các biến kết quả nhị phân. Trong mơ hình probit, phân bố chuẩn bình thường của xác suất được mơ hình hóa như một sự kết hợp tuyến tính của các yếu tố dự báo. Phương pháp hồi quy được sử dụng để xác định các thông số EC50, LC50, NOEC, LOEC. EC50 và LC50 được tính theo phương pháp Probit thơng qua phương trình hồi quy Y = y0 + ax bằng phần mềm Sigmaplot, Excel hoặc các phần mềm SPSS, SAS và được thực hiện theo quy trình của Yu và cộng sự [88] và Bảng hồi quy Probit (Bảng 2.5).
Bảng 2. 5. Bảng quy đổi hệ số Probit
% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 ̶̶ 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 ̶̶ 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09
2.6.2. Phương pháp phân tích qRT-PCR để đánh giá ảnh hưởng của hóa chất BVTV đến cá medaka ở mức độ sinh học phân tử
RT-PCR là kỹ thuật thực hiện phản ứng chuỗi polymerase định lượng (RT- PCR) để khuếch đại trình tự nucleotide ngắn từ một lượng nhỏ của các mơ và có thể tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản của một trình tự ADN đặc hiệu. Kỹ thuật RT- PCR có thể xác định biểu hiện kiểu gen khác nhau của các động vật thủy sinh ở mức độ gen thông thường nên ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc giám sát môi trường ô nhiễm.
Kết quả ảnh hưởng của hóa chất BVTV DDT lên hệ gen của cá medaka trong luận án này được kiểm tra bằng phương pháp phân tích RT-PCR (LightCycler® 96 System- Roche Life Science). Mẫu sau khi phơi nhiễm với DDT lần lượt được thực hiện: phân tách RNA, tổng hợp cDNA, và phân tích RT-PCR. Qui trình cụ thể được thực hiện như Hình 2.8 dưới đây:
Hình 2. 8. Quy trình tóm tắt chuẩn bị mẫu và phân tích Real-time PCR
Trình tự mã hóa của 4 gen lựa chọn được lấy từ cơ sở dữ liệu GenBank (PubMed-NCBI) và HGNC (Ensembl, EMBL–EBI). Trình tự của mỗi cặp mồi mã hóa được trình bày theo cơng bố của Barjhoux và cộng sự [89]. Đối với mỗi gen, các cặp mồi cụ thể được xác định bằng phần mềm LightCycler probe design software
(v1.0, Roche, Meylan,France) và được đề cập trong Bảng 2.6. Phân tích biểu hiện gen được thực hiện trên các mẫu phôi và cá medaka trưởng thành theo quy trình thời gian và nhiệt độ (Bảng 2.7).
Bảng 2. 6. Các cặp mồi phân tích Real-time PCR
Cặp mồi
Mã số cập (EMBL
hoặc GenBank) Trình tự (5’ – 3’) Chức năng
β-actin S74868 GTGACCCACACAGTGCCa Gen đối chứng
GCGACGTAGCACAGCTTCb
p53 AF212997 TCTGGCACTGCAAAGTCTGTa Điều hòa chu kỳ
CCTCGTTTTGGTGGTGGGb tế bào
GCATCATCAAGACGGTGGAGa Điều hòa sự tăng
rarα1 EF546452 trưởng và biệt
GGCGAAAGCGAAAACCAGGb hóa của tế bào
wnt AJ243208 CCGCTTTGACGGAGCATa Tăng sinh tế bào
TTGAACCCACGCCCACAGCb và sinh sản
a: mồi xuôi b: mồi ngược
Bảng 2. 7. Cài đặt quy trình phân tích phản ứng Real-time PCR
Thứ tự Số chu kỳ lập lại Nhiệt độ (o
C) Thời gian (phút) Bước 1 1X 95 5 94 0,5 Bước 2 40X 50 0,5 72 0,5 Bước 3 1X 72 5 Bước 4 81X 65–95 0,5
Để có kết quả chính xác về độc tính của DDT đối với cá medaka, phân tích RT- PCR xác định những thay đổi về mức độ sinh học phân tử của gen cá trước và sau khi phơi nhiễm với DDT đã được khảo sát. Phôi và cá medeka trưởng thành được phơi nhiễm với hóa chất BVTV DDT ở nồng độ 1500 và 1700 g/L trong vịng 24
giờ mà khơng cho ăn. Sau khi phơi nhiễm, phôi cá và cá trưởng thành sẽ được giữ trong -80oC cho đến khi phân tích RT-PCR.
2.6.3. Các phương pháp quan sát hình thái, cấu tạo tế bào
2.6.3.1. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope):
Phương pháp này được sử dụng để xác định hình thái bề mặt và kích thước các bào quan sinh vật thí nghiệm. Kính hiển vi điện tử quét SEM quét bề mặt mẫu bằng một chùm tia điện tử hội tụ cao trong chân khơng, thu thập thơng tin (tín hiệu) từ mẫu phát ra, tái tạo thành một hình ảnh lớn hơn cấu trúc bề mặt của mẫu thơng qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu [90].
Trong luận án này, mẫu mô sinh vật hàu và cá được ly tâm (5000v/p) trong 10 phút để thu sinh khối tế tào. Tiếp theo, mẫu tế bào được xử lý trong dung dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1M, pH = 7,2-7,4. Mẫu tiếp tục được rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M và cố định lại bằng dung dịch OsO4 1% trong cacodylate 0,1M. Sau khi để khô, mẫu được đưa lên đế, phủ màng dẫn điện Pt-Pd. Mẫu tế bào được quan sát dưới kính SEM HITACHI S4800 tại Phịng kính hiển vi điện tử, Viện vệ sinh Dịch Tễ trung ương.
2.6.3.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscopy)
Phương pháp này có độ phân giải cao dùng để nghiên cứu hình thái, cấu trúc của các bào quan sau khi sinh vật phơi nhiễm với hóa chất BVTV. Kính hoạt động trên nguyên lý nguồn phát xạ trên đỉnh sẽ phát ra chùm tia điện tử, sau khi đi qua tụ kính chùm điện tử sẽ tác động lên mẫu mỏng. Tùy thuộc vào từng loại mẫu và vị trí chụp mà chùm điện tử bị tán xạ nhiều hay ít. Mật độ điện tử truyền qua ngay dưới mặt mẫu phản ánh tình trạng của mẫu, hình ảnh này sẽ được phóng đại qua một loạt các thấu kính trung gian và thể hiện trên màn huỳnh quang [90].
Tương tự, mẫu mô sinh vật hàu và cá được ly tâm (5000v/p) trong 10 phút để thu sinh khối tế tào. Mẫu các tế bào sau đó được xử lý trong dung dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1M, pH = 7,2 – 7,4. Mẫu tiếp tục được rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M và cố định lại bằng dung dịch OsO4 1% trong cacodylate 0,1M. Sau đó mẫu sẽ được xử lý bằng cách kết tinh trong epoxyresin; cắt lát siêu mỏng ở
mức 50 - 100nm và nhuộm bằng Uranyl Acetate rồi quan sát lát cắt bằng kính hiển
vi điện tử truyền qua (TEM) ở các độ phóng đại có hệ số phóng đại M = 50 - 600.000,
độ phân giải δ = 3 Å, điện áp gia tốc U = 40 – 100kV để quan sát sự khác biệt vi cấu trúc giữa tế bào đối chứng (khơng phơi nhiễm với DDT) và mẫu thực nghiệm (có phơi nhiễm với DDT). Trong luận án này, mẫu tế bào được quan sát dưới kính (TEM) JEOL 1010 (JEOL - Nhật Bản) tại Phịng kính hiển vi điện tử, Viện vệ sinh