CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Các phương pháp đánh giá độc tính
2.6.1. Xác định LC50, EC50 và tỷ lệ sống chết
Tỷ lệ phôi, ấu trùng hàu và cá tử vong thực tế của các nồng độ thử nghiệm sau 24, 48, 72 và 96 giờ thí nghiệm được tính theo cơng thức Abbott và WHO như sau:
Tỷ lệ tử vong thực tế = (tỷ lệ sống mẫu đối chứng−tỷ lệ sống mẫu thử nghiệm)×100 tỷ lệ sống mẫu đối chứng
Hồi quy Probit, cịn được gọi là mơ hình probit, được sử dụng để mơ hình các biến kết quả nhị phân. Trong mơ hình probit, phân bố chuẩn bình thường của xác suất được mơ hình hóa như một sự kết hợp tuyến tính của các yếu tố dự báo. Phương pháp hồi quy được sử dụng để xác định các thông số EC50, LC50, NOEC, LOEC. EC50 và LC50 được tính theo phương pháp Probit thơng qua phương trình hồi quy Y = y0 + ax bằng phần mềm Sigmaplot, Excel hoặc các phần mềm SPSS, SAS và được thực hiện theo quy trình của Yu và cộng sự [88] và Bảng hồi quy Probit (Bảng 2.5).
Bảng 2. 5. Bảng quy đổi hệ số Probit
% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 ̶̶ 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 ̶̶ 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09
2.6.2. Phương pháp phân tích qRT-PCR để đánh giá ảnh hưởng của hóa chất BVTV đến cá medaka ở mức độ sinh học phân tử
RT-PCR là kỹ thuật thực hiện phản ứng chuỗi polymerase định lượng (RT- PCR) để khuếch đại trình tự nucleotide ngắn từ một lượng nhỏ của các mơ và có thể tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản của một trình tự ADN đặc hiệu. Kỹ thuật RT- PCR có thể xác định biểu hiện kiểu gen khác nhau của các động vật thủy sinh ở mức độ gen thông thường nên ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc giám sát mơi trường ơ nhiễm.
Kết quả ảnh hưởng của hóa chất BVTV DDT lên hệ gen của cá medaka trong luận án này được kiểm tra bằng phương pháp phân tích RT-PCR (LightCycler® 96 System- Roche Life Science). Mẫu sau khi phơi nhiễm với DDT lần lượt được thực hiện: phân tách RNA, tổng hợp cDNA, và phân tích RT-PCR. Qui trình cụ thể được thực hiện như Hình 2.8 dưới đây:
Hình 2. 8. Quy trình tóm tắt chuẩn bị mẫu và phân tích Real-time PCR
Trình tự mã hóa của 4 gen lựa chọn được lấy từ cơ sở dữ liệu GenBank (PubMed-NCBI) và HGNC (Ensembl, EMBL–EBI). Trình tự của mỗi cặp mồi mã hóa được trình bày theo cơng bố của Barjhoux và cộng sự [89]. Đối với mỗi gen, các cặp mồi cụ thể được xác định bằng phần mềm LightCycler probe design software
(v1.0, Roche, Meylan,France) và được đề cập trong Bảng 2.6. Phân tích biểu hiện gen được thực hiện trên các mẫu phơi và cá medaka trưởng thành theo quy trình thời gian và nhiệt độ (Bảng 2.7).
Bảng 2. 6. Các cặp mồi phân tích Real-time PCR
Cặp mồi
Mã số cập (EMBL
hoặc GenBank) Trình tự (5’ – 3’) Chức năng
β-actin S74868 GTGACCCACACAGTGCCa Gen đối chứng
GCGACGTAGCACAGCTTCb
p53 AF212997 TCTGGCACTGCAAAGTCTGTa Điều hòa chu kỳ
CCTCGTTTTGGTGGTGGGb tế bào
GCATCATCAAGACGGTGGAGa Điều hòa sự tăng
rarα1 EF546452 trưởng và biệt
GGCGAAAGCGAAAACCAGGb hóa của tế bào
wnt AJ243208 CCGCTTTGACGGAGCATa Tăng sinh tế bào
TTGAACCCACGCCCACAGCb và sinh sản
a: mồi xuôi b: mồi ngược
Bảng 2. 7. Cài đặt quy trình phân tích phản ứng Real-time PCR
Thứ tự Số chu kỳ lập lại Nhiệt độ (o
C) Thời gian (phút) Bước 1 1X 95 5 94 0,5 Bước 2 40X 50 0,5 72 0,5 Bước 3 1X 72 5 Bước 4 81X 65–95 0,5
Để có kết quả chính xác về độc tính của DDT đối với cá medaka, phân tích RT- PCR xác định những thay đổi về mức độ sinh học phân tử của gen cá trước và sau khi phơi nhiễm với DDT đã được khảo sát. Phơi và cá medeka trưởng thành được phơi nhiễm với hóa chất BVTV DDT ở nồng độ 1500 và 1700 g/L trong vịng 24
giờ mà khơng cho ăn. Sau khi phơi nhiễm, phôi cá và cá trưởng thành sẽ được giữ trong -80oC cho đến khi phân tích RT-PCR.
2.6.3. Các phương pháp quan sát hình thái, cấu tạo tế bào
2.6.3.1. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope):
Phương pháp này được sử dụng để xác định hình thái bề mặt và kích thước các bào quan sinh vật thí nghiệm. Kính hiển vi điện tử quét SEM quét bề mặt mẫu bằng một chùm tia điện tử hội tụ cao trong chân khơng, thu thập thơng tin (tín hiệu) từ mẫu phát ra, tái tạo thành một hình ảnh lớn hơn cấu trúc bề mặt của mẫu thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu [90].
Trong luận án này, mẫu mô sinh vật hàu và cá được ly tâm (5000v/p) trong 10 phút để thu sinh khối tế tào. Tiếp theo, mẫu tế bào được xử lý trong dung dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1M, pH = 7,2-7,4. Mẫu tiếp tục được rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M và cố định lại bằng dung dịch OsO4 1% trong cacodylate 0,1M. Sau khi để khô, mẫu được đưa lên đế, phủ màng dẫn điện Pt-Pd. Mẫu tế bào được quan sát dưới kính SEM HITACHI S4800 tại Phịng kính hiển vi điện tử, Viện vệ sinh Dịch Tễ trung ương.
2.6.3.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscopy)
Phương pháp này có độ phân giải cao dùng để nghiên cứu hình thái, cấu trúc của các bào quan sau khi sinh vật phơi nhiễm với hóa chất BVTV. Kính hoạt động trên ngun lý nguồn phát xạ trên đỉnh sẽ phát ra chùm tia điện tử, sau khi đi qua tụ kính chùm điện tử sẽ tác động lên mẫu mỏng. Tùy thuộc vào từng loại mẫu và vị trí chụp mà chùm điện tử bị tán xạ nhiều hay ít. Mật độ điện tử truyền qua ngay dưới mặt mẫu phản ánh tình trạng của mẫu, hình ảnh này sẽ được phóng đại qua một loạt các thấu kính trung gian và thể hiện trên màn huỳnh quang [90].
Tương tự, mẫu mô sinh vật hàu và cá được ly tâm (5000v/p) trong 10 phút để thu sinh khối tế tào. Mẫu các tế bào sau đó được xử lý trong dung dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1M, pH = 7,2 – 7,4. Mẫu tiếp tục được rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M và cố định lại bằng dung dịch OsO4 1% trong cacodylate 0,1M. Sau đó mẫu sẽ được xử lý bằng cách kết tinh trong epoxyresin; cắt lát siêu mỏng ở
mức 50 - 100nm và nhuộm bằng Uranyl Acetate rồi quan sát lát cắt bằng kính hiển
vi điện tử truyền qua (TEM) ở các độ phóng đại có hệ số phóng đại M = 50 - 600.000,
độ phân giải δ = 3 Å, điện áp gia tốc U = 40 – 100kV để quan sát sự khác biệt vi cấu trúc giữa tế bào đối chứng (khơng phơi nhiễm với DDT) và mẫu thực nghiệm (có phơi nhiễm với DDT). Trong luận án này, mẫu tế bào được quan sát dưới kính (TEM) JEOL 1010 (JEOL - Nhật Bản) tại Phịng kính hiển vi điện tử, Viện vệ sinh Dịch Tễ trung ương.