BỆNH TCC
- Ứng cử viên ựầu tiên của vacxin RV là vacxin ựơn giá ỘMonovalent vaccinesỢ sử dụng chủng RV WC3 ựược phân lập từ vật chủ là bò hoặc từ khỉ Rhesus. đây là loại vacxin uống sống giảm ựộc uống một liều duy nhất. Vắc xin này an toàn và có thể ngăn chặn ựược bệnh tiêu chảy do RV ở trẻ em.
- Vacxin thứ hai là các vacxin ựa giá ỘMultivalent vaccinesỢ ựược sản xuất năm 1985 bằng cách sử dụng sự thay thế gen. Một gen trong hệ gen của chủng RV ựộng vật ựược thay thế bởi gen của RV người, gen này mã hoá cho VP7 [4,6].
- Rota Shield là vacxin tứ liên ỘTetravalent vaccinesỢ ựược phát triển bởi chủng RV MMU180006, là vacxin sống giảm ựộc lực uống ựược sản xuất từ chủng RV ở khỉ Rhesus (RRV-TV). Chủng này có cùng ựặc tắnh trung hoà với các chủng RV G3 của người, MMU18006 phù hợp cho việc phát triển vacxin bởi vì nó phát triển tốt trong nuôi cấy tế bào. So với các vacxin dùng các chủng RV bò, MMU 18006 an toàn và tạo miễn dịch tốt. Các thử nghiệm lâm sàng ở trẻ em tại Bắc Mỹ, Nam Mỹ và châu Âu cho thấy RotaShield và vắc xin an toàn và rất hiệu quả. Vắc xin này ựược cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, 600.000 trẻ ựược sử dụng vắc xin tương
ựương với 1,2 triệu liều. Vắc xin này bị ựình chỉ sử dụng vì có liên quan ựến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều ựầu tiên với tỷ lệ ước tắnh 1/10.000 liều.
- Các loại vacxin ựã ựược phê chuẩn sử dụng :
Hội nghị về RV quốc tế lần thứ 6 ựược tổ chức ngày 7,8 tháng 1 năm 2005 tại Mexico ựã thông qua và phê chuẩn 2 vacxin Rota ựó là vắc xin RotaTeq của Meck và vắc xin Rotarix của Smith Line, cả hai loại vắc xin này ựã ựược WHO phê chuẩn sử dụng tháng 1 năm 2006 [4].
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. đối tượng nghiên cứu
- Trẻ em bị tiêu chảy cấp vào viện Nhi Thủy điển năm 2009.
2.1.2. Mẫu bệnh phẩm
1088 mẫu phân của trẻ em từ 0-5 tuổi bị mắc TCC ựiệu trị tại bệnh viện Nhi Thủy điển năm 2009.
2.1.3. Hoá chất, dụng cụ, máy móc dùng cho chẩn ựoán mẫu phân bằng phương pháp ELISA
Hoá chất: Bộ sinh phẩm chẩn ựoán virut rota của hãng DACO bao gồm:
- Chứng dương (lọ 5ml): Chứa virus Rota của Bò ựã bất hoạt (thuộc chủng 3209176) trong ựệm chứa kháng sinh và có màu ựỏ.
- Chứng âm : dung dịch PBS
- Một lọ Conjugate (13ml): chứa kháng thể ựa dòng từ Thỏ liên kết với Enzyme peroxidase của cấy củ cải ngựa hòa tan trong ựệm protein chứa kháng sinh có màu xanh.
- Một lọ dung dịch rửa 50ml (Wash buffer) ựặc 25 lần - Một lọ cơ chất A: chứa ure peroxidase
- Một lọ cơ chất B Substrate TMB (13ml): chứa peroxide và 3,3Ỗ Ờ 5,5Ỗ Ờ tetramethylbenzidine trong ựệm loãng (dung dịch tạo màu)
- Một lọ dung dịch dừng phản ứng 12ml (Stop solution): 0,46 mol/l axit H2SO4
- Giếng nhựa vi lượng có gắn kháng thể ựơn dòng kháng RV. - Giá gắn giếng chuẩn ựộ vi lượng
Dụng cụ làm phản ứng
- Pipet man loại 1000ộm và 200ộm, ựầu côn tương ứng, Eppendoff ml, giá ựựng Eppendoff, máy ựọc ELISA.
- Cồn 900 và bông cồn - Các dụng cụ khác
2.1.4. Nguyên vật liệu sử dụng cho tách chiết RNA từ mẫu phân
- Pipet man (1000ộl, 200ộl, 5 - 50ộl), Eppendoft 1,7ml, giá ựựng, máy vontex, máy ly tâm, bể ổn nhiệt.
- Các ống thu mẫu (collect tube) và cột tách mẫu (spin) - Nước vô trùng, vertrel
- Etanol (96 Ờ 100%)
- AW1, AW2 (ựều thêm ethanol)
- Buffer AVL Ờ RNA carrier, buffer AVE Ờ RNA carrier
Cách pha: n ừ 0,56 ml = x ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
x ừ 10 ộl/ml RNA carrier = y ộl
Với: n = số mẫu tách chiết, x = số ml AVE/AVL cần dùng, y = số ộl AVE Ờ RNA carrier/AVL Ờ RNA carrier
2.1.5 Nguyên vật liệu và hóa chất sử dụng cho quá trình chạy PCR
(Theo chương trình của Australia)
- Dụng cụ chung: Pipet man (1000ộl, 200ộl, 5 - 50ộl), ựầu côn tương ứng, Eppendorf (1,7ml và 0,5ml), giá ựựng eppendotf, khay ựựng ựá, máy PCR, máy ly tâm, và các dụng cụ khác.
2.1.5.1. định typ G - Master Mix Ờ PCR 1 - PCR 2 Thành phần 1X (ộl) cDNA 5 Buffer 10X (contain Mg2+) 10 dNTPs (2,5 mM) 8 VP4-F (100 ng) 1 Pmix (100 ng) 6
H2O (DEPC, deionized) 69.7
Taq 0.3 Total 100 Thành phần 1X (ộl) RNA 5 Buffer 10X (contain Mg2+) 10 dNTPs (2,5 mM) 8 DMSO 7 VP7-F (100 ng) 1 VP7-R (100 ng) 1
H2O (DEPC, deionized) 67.5
- Cấu trúc các ựoạn mồi dùng trong ựịnh typ G
Primers cho G-Typing -50nmol
1. VP7-R 5'ACC TTG CCA CCA TTT TTT CC 3'
2. VP7-F 5'ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC 3'
3. Genotype G1 aBT1 5' CAA GTA CTC AAA TCA ATG
ATG G 3'
4. GenotypeG2 aCT2 5'CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC
TGTG 3'
5. Genotype G3 5' ACG AAC TCA ACA CGA GAG G 3'
6. Genotype G4 aDT4 5' CGT TTC TGG TGA GGA GTT G
3'
7. Genotype G8 aAT8 5' CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC
3'
8. Genotype G9 5' CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC 3'
9. Genotype G10 5' ATG TCA GAC TAC ARA TAC TGG 3'
2.1.5.2. định typ P - Master Mix Ờ PCR 1 Thành phần 1X (ộl) RNA 5 Buffer 10X (contain Mg2+) 10 dNTPs (2,5 mM) 8 DMSO 7 VP4-F (100 ng) 1 VP4-R (100 ng) 1
H2O (DEPC, deionized) 67.5
Total 99.5
- PCR 2 Thành phần 1X (ộl) cDNA 5 Buffer 10X (contain Mg2+) 10 dNTPs (2,5 mM) 8 VP4-F (100 ng) 1 Pmix (100 ng) 6 H2O (DEPC, deionized) 69.7 Taq 0.3 Total 100
- Cấu trúc các ựoạn mồi dùng trong ựịnh typ P
Primers cho P Typing- 50nmol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1. VP4-F 5'TAT GCT CCA GTN AAT TGG 3'
2. VP4-R 5' ATT GCA TTT CTT ATA ATG 3'
3. P[4] (previously genogroup 2) 2T-1 5' CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC 3'
4. P[6] (previously genogroup 3) 3T-1 5'TGT TGA TTA
GTT GGA TTC AA 3'
5. P[8] (previously genogroup 1) 1T-1D 5' TCT ACT GGT TTR CAN TGC 3'
6. P[9] (previously genogroup 4) 4T-1 5' TGA GAC
ATG CAA TTG GAC 3'
7. P[10] (previously genogroup 5) 5T-1 5' ATC ATA GTT AGT AGT CGG 3'
8. P[11] P[11] 5' GTA AAC ATC CAG AAT GTG 3'
2.1.6. Nguyên vật liệu và máy móc sử dụng cho chạy ựiện di
- Thạch 1,5 % (Nueve/Seaplaque = 2ọ1) - Khay ựổ thạch và lược
- Bể ựiện di
- Ethidium Bromide - Phim chụp ảnh bản gel - Máy chụp ảnh và ựọc kết quả
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp miễn dịch - enzyme (ELISA) 2.2.1.1. Nguyên lý phương pháp ELISA 2.2.1.1. Nguyên lý phương pháp ELISA
Kháng thể ựược gắn vào các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có thể có trong mẫu bệnh phẩm. Phức hợp kháng nguyên Ờ kháng thể này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzyme tạo thành phức hợp KT + KN + KT Ờ enzyme. Khi cho cơ chất vào enzyme sẽ làm cơ chất biến ựổi màu.
Nếu trong mẫu bệnh phẩm không có kháng nguyên thì phức hợp trên sẽ không ựược tạo thành, nên không thể làm biến ựổi màu của cơ chất.
Căn cứ vào mức ựộ biến ựổi màu mà nhận biết ựược phản ứng dương tắnh hay âm tắnh. Nếu dùng phương pháp này với sự biến ựổi màu ta chỉ xác ựịnh ựược sự có mặt của RV một cách ựịnh tắnh.
2.2.1.2. Các bước tiến hành
- Lấy mẫu ựông làm tan ở nhiệt ựộ phòng.
- Dùng pipet man hút 900 ộl dung dịch dùng ựể pha loãng mẫu cho vào eppendoft 2ml ựã ựánh số thứ tự.
- Dùng pipet man hút 100ộl mẫu phân cho vào 900ộl dung dịch dùng dể pha loãng mẫu ở trên, vontex.
- Nhỏ 2 giọt ựối chứng dương vào giếng ựánh dấu là ựối chứng dương (tương ựương 100ộl).
- Nhỏ 2 giọt ựối chứng âm vào giếng ựã ựánh dấu ựối chứng âm - Dùng pipet man hút 100ộl các mẫu phân sau khi pha loãng vào các giếng ựã ựánh dấu tương ứng.
- Nhỏ 2 giọt conjugate vào tất cả các giếng (tương ựương 100ộl).
- để ở nhiệt ựộ phòng 200C Ờ 300C trong vòng 60 phút ổ 5 phút. - đổ hết dịch trong toàn bộ giếng, ựập mạnh phiến nhựa vào giấy thấm nhằm làm khô hoàn toàn các giếng ựã phản ứng.
- Rửa bằng nước rửa (wash buffer pha loãng 25 lần) 5 lần và làm khô các gieengs như bước trên.
- Nhỏ 2 giọt cơ chất A (100ộl) vào mỗi giếng.
- Thêm 2 giọt (100ộl) substrate TMB, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thêm tiếp 2 giọt stop solution.
2.2.1.3. đọc kết quả
đọc kết quả bằng mắt thường
So sánh màu của mẫu với màu của chứng dương và chứng âm: - Chứng dương: Có màu xanh khi chưa nhỏ dung dịch dừng phản ứng và có màu vàng khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng.
- Chứng âm: Không màu.
Kết quả:
+ Mẫu nào không màu như ựối chứng âm ựược coi là âm tắnh, không có RV trong mẫu (Rotaclone(-)).
+ Mẫu nào có màu như ựối chứng dương ựược coi là dương tắnh, có RV trong mẫu (Rotaclone(+)).
b. Dùng máy ELISA: đọc trong khoảng bước sóng 450nm Ờ 630nm.
Kết luận:
+ Những mẫu có ựơn vị hấp phụ < 0,15 là âm tắnh, không có RV trong mẫu.
+ Những mẫu có ựơn vị hấp phụ > 0,15 là dương tắnh, có RV trong mẫu.
2.2.2. Tách RNA từ mẫu phân theo Kit Qiagen
- Chọn mẫu:
Chọn ngẫu nhiên các mẫu phân của trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy ựược ựiều trị tại Bênh viện nhi Trung Ương năm 2008. Các mẫu phân này có kết quả ELISA dương tắnh với RV.
Các mẫu bệnh phẩm ựược bảo quản ở -200C, ựông tan qua ựêm trước khi tiến hành tách chiết RNA.
Tiến hành: Pha loãng mẫu phân bằng PBS (+) theo tỉ lệ 3ml mẫu phân + 7ml PBS (+).
- B1: Lấy 200ộl dung dịch từng mẫu phân ựã pha loãng cho vào mỗi eppendotf 1,7ml; thêm 200ộl vertrel/mẫu. Thời gian vontex: 1 phút. Li tâm: 10 phút, 3.000 vòng/phút.
- B2: Lấy 140ộl dịch chiết ở trên, thêm AVL (AVL - RNA carrier): 560ộl/mẫu. Lắc, ủ ở nhịêt ựộ phòng: 10 phút.
- B3: Thêm 560ộl Ethanol /mẫu. Lắc, ủ ở nhịêt ựộ phòng: 1 phút.
- B4: Chạy cột lần 1: thêm 630ộl dịch ở B3. Li tâm: 1 phút, 8.000 vòng/phút, ựổ phần nước nổi ựi.
- B5: Chạy cột lần 2: thêm tiếp 630ộl dịch (trong phần còn lại ở B3).
Li tâm: 1 phút, 8.000 vòng/phút. Thay ống thu mẫu (collect tube) bằng ống mới.
- B6: Thêm 560ộl dung dịch rửa AW1 (có ethanol). Li tâm: 1 phút, 8.000 vòng/phút. Thay ống thu mẫu (collect tube) bằng ống mới.
- B7: Thêm 560ộl dung dịch rửa AW2 (có ethanol). Li tâm: 3 phút, 14.000 vòng/phút. Thay ống thu mẫu (collect tube) bằng eppendoft 1,7ml mới.
- B8: Hút 50ộl elution solution, thêm 60ộl buffer AVE Ờ RNA carrier, ủ ở nhịêt ựộ phòng: 1 phút. Li tâm: 8000 vòng/phút.
VARN thu ựược/mẫu: 35ộl, các mẫu tách chiết xong ựược giữ ở -200C.
2.2.3. Các bước phản ứng chuỗi khuếch ựại sao chép ngược xác ựịnh kiểu gen P và G kiểu gen P và G
Phương pháp:
- Tắnh số lượng mẫu cần làm + 1 mẫu chứng (+) và 1 mẫu chứng (-). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị các eppendotf 0,5ml và ựánh số theo mẫu ựã tách chiết bao gồm cả mẫu chứng (+) và chứng (-), xếp theo thứ tự trên giá cắm (chuẩn bị cho cả PCR1 và PCR2).
- Pha dNTP 2,5 mM từ 100 mM: 10ộl dTTP, 10ộl dCTP, 10ộl dGTP, 10dATPộ, 360ộl dH2O, thu ựược 400ộl dNTP 2,5mM.
- Pha hỗn dịch PCR2 (theo 2.1.5, chưa có cDNA).
- Tất cả các thành phần trên ựược tắnh ựủ cho số mẫu cần làm mỗi lần, 1 mẫu tắnh dư, 1 mẫu (+) và 1 mẫu (-). Sau khi pha xong ựược bảo quản trong khay ựá.
2.2.3.1. định typ G
.Master Mix: Hút 94,5ộl hỗn dịch Master mix vào từng eppendorf ựã chuẩn bị sẵn + 5ộl RNA mỗi mẫu.
-Biến tắnh ARN: 97ồC/ 5 phút -Sốc nhiệt trong khay ựá 1 phút -Cho tiếp 0.2 ộl Amply RT/ mẫu -Cho tiếp 0.3ộl Taq/ mẫu
-Vontex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tupe vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
.Chu trình nhiệt PCR 1 - 420C Ờ 60 phút
- (940C Ờ 1 phút; 420C Ờ 2 phút; 680C Ờ 1 phút) x 30 chu kỳ - Giữ 40C.
.Chu trình nhiệt PCR 2
- Thực hiện PCR2: Hút 1ộl mỗi mẫu mẫu cDNA (sản phẩm PCR1) với 99ộl hỗn dịch PCR2 vào các eppendotf ựã chuẩn bị sẵn, Vontex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tupe vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
- (940C Ờ 1 phút; 420C Ờ 2 phút; 680C Ờ 1 phút) x 40 chu kì - Giữ 40C
2.2.3.2. định typ P
.Master Mix: Hút 5ộl RNA mỗi mẫu với 94,5ộl hỗn dịch Master mix vào từng Eppendotf ựã chuẩn bị sẵn.
- Biến tắnh ARN: 97ồC/ 5 phút - Sốc nhiệt trong khay ựá 1 phút - Cho tiếp 0,2 ộl RT/ mẫu - Cho tiếp 0,3 ộl Taq/ mẫu
- Voltex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tube vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
.Chu trình nhiệt PCR1: - 420C Ờ 60 phút
- (940C Ờ 1 phút; 500C Ờ 2 phút; 720C Ờ 1 phút) x 30 chu kì - Giữ 40C
.Chu trình nhiệt PCR2:
- Thực hiện PCR2: Hút 5ộl mỗi mẫu cDNA (sản phẩm PCR1) với 95ộl hỗn dịch PCR2 vào từng các Eppendotf ựã chuẩn bị sẵn. Voltex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tube vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
- 940C Ờ 2 phút - (940C Ờ 1 phút; 500C Ờ 2 phút; 720C Ờ 1 phút) x 40 chu kì - Giữ 40C
2.2.4. Chạy ựiện di và ựọc kết quả 2.2.4.1. Pha thạch, ựệm và chạy ựiện di 2.2.4.1. Pha thạch, ựệm và chạy ựiện di
- Pha TBE 5X: 6,785g Boric axit; 13,75g Tris Ờ base; 25ml EDTA 0,1M (pH=8) hoặc 5ml EDTA 0,5M, 250ml nước. Hòa tan hoàn toàn.
- Chuẩn bị TBE buffer 0,5X cho vào bể ựiện di (pha loãng TBE 0,5X) .
- Pha thạch agarose 1,5% như sau: Cân chắnh xác: 2g Nusieve + 1g Seaplaque pha trong 200ml TBE 0,5X.
- Cho tan 100% agar trong 30s bằng lò vi sóng; lắc nhẹ ựể mix; cho tiếp vào lò vi sóng khoảng 10 - 15s, ựến khi có hiện tượng sôi thì dừng lại, lắc nhẹ; làm nóng tiếp cho ựến khi dung dịch trong suốt; làm nguội dung dịch ựến 550C.
- đổ thạch vào máng ựã cắm lược 16 răng, ựợi khoảng 30 - 45 phút cho thạch ựông hoàn toàn, nhẹ nhàng rút lược ra rồi ựưa bản gel vào bể ựiện di có chứa dung dịch ựệm TBE 0,5X. điều chỉnh cho dung dịch ựệm ựiện di ngập bản gel khoảng 1mm.
- Xác ựịnh số mẫu chạy ựiện di gồm cả chứng (-) và chứng (+), thang chuẩn Marker 100bp.
- Hút 10ộl cDNA + 5ộl gel loading buffer. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tra mẫu vào mỗi giếng (10ộl - 15 ộl) theo trật tự sau: MW Marker 100bp tra vào giữa bản gel, tiếp ựến các mẫu ựược tra lần lượt kể từ các mẫu chứng (+), chứng (-).
- Chạy ựiện di: Chạy trong 1h ở 100V, cho ựến khi vạch chạy 3/4 bản gel thì dừng lại. Nguyên lý: các cDNA có xu hướng di chuyển sang cực (+) sang cực (-), do vậy cần cắm dây cho phù hợp.
2.2.4.2. Nhuộm bản gel
Pha 500ml Ethydium Bromide (tỷ lệ 5ộl Ethydium Bromide + 100ml nước cất). Nhuộm gel trong 30 Ờ 40 phút, vớt sang khay ựựng nước ựể rửa bớt hóa chất. Sau khi nhuộm có thể soi gel dưới ựèn UV và chụp ảnh. Khay ựựng Ethydium Bromide sau khi dùng phải ựậy kắn tránh ánh sáng, ựặt nơi an toàn (do hóa chất rất ựộc), có thể sử dụng nhiều lần.
2.2.4.3. đọc kết quả
Tùy thuộc vào vị trắ của Ộdải băngỢ tương ứng với mức bp (base pair) trên thang chuẩn MW Marker 100bp cho ta biết kết quả của kiểu gen P và G tương ứng.
Bảng 3. Thang ựo type P và type G hiện hành tại Việt Nam
Type G Type P P11 141 G9 179 P6 462 G4 452 P8 270 G2 521 P9 224 G1 618 P4 146 G3 682 P10 462 G8 754
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC đỊNH TỶ LỆ TCC DO RV VÀO BỆNH VIỆN NHI THỤY đIỂN NĂM 2009 đIỂN NĂM 2009
Chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA ựể phát hiện RV trong toàn bộ số