- Chọn mẫu:
Chọn ngẫu nhiên các mẫu phân của trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy ựược ựiều trị tại Bênh viện nhi Trung Ương năm 2008. Các mẫu phân này có kết quả ELISA dương tắnh với RV.
Các mẫu bệnh phẩm ựược bảo quản ở -200C, ựông tan qua ựêm trước khi tiến hành tách chiết RNA.
Tiến hành: Pha loãng mẫu phân bằng PBS (+) theo tỉ lệ 3ml mẫu phân + 7ml PBS (+).
- B1: Lấy 200ộl dung dịch từng mẫu phân ựã pha loãng cho vào mỗi eppendotf 1,7ml; thêm 200ộl vertrel/mẫu. Thời gian vontex: 1 phút. Li tâm: 10 phút, 3.000 vòng/phút.
- B2: Lấy 140ộl dịch chiết ở trên, thêm AVL (AVL - RNA carrier): 560ộl/mẫu. Lắc, ủ ở nhịêt ựộ phòng: 10 phút.
- B3: Thêm 560ộl Ethanol /mẫu. Lắc, ủ ở nhịêt ựộ phòng: 1 phút.
- B4: Chạy cột lần 1: thêm 630ộl dịch ở B3. Li tâm: 1 phút, 8.000 vòng/phút, ựổ phần nước nổi ựi.
- B5: Chạy cột lần 2: thêm tiếp 630ộl dịch (trong phần còn lại ở B3).
Li tâm: 1 phút, 8.000 vòng/phút. Thay ống thu mẫu (collect tube) bằng ống mới.
- B6: Thêm 560ộl dung dịch rửa AW1 (có ethanol). Li tâm: 1 phút, 8.000 vòng/phút. Thay ống thu mẫu (collect tube) bằng ống mới.
- B7: Thêm 560ộl dung dịch rửa AW2 (có ethanol). Li tâm: 3 phút, 14.000 vòng/phút. Thay ống thu mẫu (collect tube) bằng eppendoft 1,7ml mới.
- B8: Hút 50ộl elution solution, thêm 60ộl buffer AVE Ờ RNA carrier, ủ ở nhịêt ựộ phòng: 1 phút. Li tâm: 8000 vòng/phút.
VARN thu ựược/mẫu: 35ộl, các mẫu tách chiết xong ựược giữ ở -200C.
2.2.3. Các bước phản ứng chuỗi khuếch ựại sao chép ngược xác ựịnh kiểu gen P và G