2.2.1.1. Nguyên lý phương pháp ELISA
Kháng thể ựược gắn vào các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có thể có trong mẫu bệnh phẩm. Phức hợp kháng nguyên Ờ kháng thể này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzyme tạo thành phức hợp KT + KN + KT Ờ enzyme. Khi cho cơ chất vào enzyme sẽ làm cơ chất biến ựổi màu.
Nếu trong mẫu bệnh phẩm không có kháng nguyên thì phức hợp trên sẽ không ựược tạo thành, nên không thể làm biến ựổi màu của cơ chất.
Căn cứ vào mức ựộ biến ựổi màu mà nhận biết ựược phản ứng dương tắnh hay âm tắnh. Nếu dùng phương pháp này với sự biến ựổi màu ta chỉ xác ựịnh ựược sự có mặt của RV một cách ựịnh tắnh.
2.2.1.2. Các bước tiến hành
- Lấy mẫu ựông làm tan ở nhiệt ựộ phòng.
- Dùng pipet man hút 900 ộl dung dịch dùng ựể pha loãng mẫu cho vào eppendoft 2ml ựã ựánh số thứ tự.
- Dùng pipet man hút 100ộl mẫu phân cho vào 900ộl dung dịch dùng dể pha loãng mẫu ở trên, vontex.
- Nhỏ 2 giọt ựối chứng dương vào giếng ựánh dấu là ựối chứng dương (tương ựương 100ộl).
- Nhỏ 2 giọt ựối chứng âm vào giếng ựã ựánh dấu ựối chứng âm - Dùng pipet man hút 100ộl các mẫu phân sau khi pha loãng vào các giếng ựã ựánh dấu tương ứng.
- Nhỏ 2 giọt conjugate vào tất cả các giếng (tương ựương 100ộl).
- để ở nhiệt ựộ phòng 200C Ờ 300C trong vòng 60 phút ổ 5 phút. - đổ hết dịch trong toàn bộ giếng, ựập mạnh phiến nhựa vào giấy thấm nhằm làm khô hoàn toàn các giếng ựã phản ứng.
- Rửa bằng nước rửa (wash buffer pha loãng 25 lần) 5 lần và làm khô các gieengs như bước trên.
- Nhỏ 2 giọt cơ chất A (100ộl) vào mỗi giếng.
- Thêm 2 giọt (100ộl) substrate TMB, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút.
- Thêm tiếp 2 giọt stop solution.
2.2.1.3. đọc kết quả
đọc kết quả bằng mắt thường
So sánh màu của mẫu với màu của chứng dương và chứng âm: - Chứng dương: Có màu xanh khi chưa nhỏ dung dịch dừng phản ứng và có màu vàng khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng.
- Chứng âm: Không màu.
Kết quả:
+ Mẫu nào không màu như ựối chứng âm ựược coi là âm tắnh, không có RV trong mẫu (Rotaclone(-)).
+ Mẫu nào có màu như ựối chứng dương ựược coi là dương tắnh, có RV trong mẫu (Rotaclone(+)).
b. Dùng máy ELISA: đọc trong khoảng bước sóng 450nm Ờ 630nm.
Kết luận:
+ Những mẫu có ựơn vị hấp phụ < 0,15 là âm tắnh, không có RV trong mẫu.
+ Những mẫu có ựơn vị hấp phụ > 0,15 là dương tắnh, có RV trong mẫu.