Phương pháp:
- Tắnh số lượng mẫu cần làm + 1 mẫu chứng (+) và 1 mẫu chứng (-).
- Chuẩn bị các eppendotf 0,5ml và ựánh số theo mẫu ựã tách chiết bao gồm cả mẫu chứng (+) và chứng (-), xếp theo thứ tự trên giá cắm (chuẩn bị cho cả PCR1 và PCR2).
- Pha dNTP 2,5 mM từ 100 mM: 10ộl dTTP, 10ộl dCTP, 10ộl dGTP, 10dATPộ, 360ộl dH2O, thu ựược 400ộl dNTP 2,5mM.
- Pha hỗn dịch PCR2 (theo 2.1.5, chưa có cDNA).
- Tất cả các thành phần trên ựược tắnh ựủ cho số mẫu cần làm mỗi lần, 1 mẫu tắnh dư, 1 mẫu (+) và 1 mẫu (-). Sau khi pha xong ựược bảo quản trong khay ựá.
2.2.3.1. định typ G
.Master Mix: Hút 94,5ộl hỗn dịch Master mix vào từng eppendorf ựã chuẩn bị sẵn + 5ộl RNA mỗi mẫu.
-Biến tắnh ARN: 97ồC/ 5 phút -Sốc nhiệt trong khay ựá 1 phút -Cho tiếp 0.2 ộl Amply RT/ mẫu -Cho tiếp 0.3ộl Taq/ mẫu
-Vontex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tupe vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
.Chu trình nhiệt PCR 1 - 420C Ờ 60 phút
- (940C Ờ 1 phút; 420C Ờ 2 phút; 680C Ờ 1 phút) x 30 chu kỳ - Giữ 40C.
.Chu trình nhiệt PCR 2
- Thực hiện PCR2: Hút 1ộl mỗi mẫu mẫu cDNA (sản phẩm PCR1) với 99ộl hỗn dịch PCR2 vào các eppendotf ựã chuẩn bị sẵn, Vontex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tupe vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
- (940C Ờ 1 phút; 420C Ờ 2 phút; 680C Ờ 1 phút) x 40 chu kì - Giữ 40C
2.2.3.2. định typ P
.Master Mix: Hút 5ộl RNA mỗi mẫu với 94,5ộl hỗn dịch Master mix vào từng Eppendotf ựã chuẩn bị sẵn.
- Biến tắnh ARN: 97ồC/ 5 phút - Sốc nhiệt trong khay ựá 1 phút - Cho tiếp 0,2 ộl RT/ mẫu - Cho tiếp 0,3 ộl Taq/ mẫu
- Voltex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tube vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
.Chu trình nhiệt PCR1: - 420C Ờ 60 phút
- (940C Ờ 1 phút; 500C Ờ 2 phút; 720C Ờ 1 phút) x 30 chu kì - Giữ 40C
.Chu trình nhiệt PCR2:
- Thực hiện PCR2: Hút 5ộl mỗi mẫu cDNA (sản phẩm PCR1) với 95ộl hỗn dịch PCR2 vào từng các Eppendotf ựã chuẩn bị sẵn. Voltex nhanh ựể trộn và ựặt các ống tube vào máy ly tâm, ly tâm ngắn 8.000 rpm rồi dừng lại. đặt các tube vào máy PCR.
- 940C Ờ 2 phút - (940C Ờ 1 phút; 500C Ờ 2 phút; 720C Ờ 1 phút) x 40 chu kì - Giữ 40C