1.10.1. đường lây truyền [4]
RV chủ yếu lây truyền theo ựường phân miệng ngoài ra còn có thể lây theo ựường hô hấp . Bệnh hiếm khi truyền từ ựộng vật sang người. Trẻ em có thể nhiễm cả trước và sau khi ốm kèm tiêu chảy. đôi khi chúng có thể ựưa virus tới những thành viên khác trong gia ựình và những người có tiếp xúc gần gũi. RV có thể gây tiêu chảy ở cả người lớn chăm sóc trẻ bị bệnh.
1.10.2. Mùa bệnh
Ở các nước khắ hậu ôn ựới, tiêu chảy do RV thường xuất hiện vào mùa ựông.
Ở các nước nhiệt ựới và các nước ựang phát triển , yếu tố mùa ắt rõ rệt hơn, bệnh có thể gặp quanh năm.
Ở Mỹ, RV gây bệnh theo mùa , ựạt cao ựiểm từ tháng 11 ựến tháng 5, với mức ựộ lưu hành bắt ựầu từ phắa Tây Nam lan sang vùng đông Bắc [4].
Ở Việt Nam theo đoàn Thị Ngọc Anh (1987) các tháng 11, 12 và một tỷ lệ phát hiện virus là 25-39,5 % so với các tháng 4, 5, 6 là 5 % - 10% [1].
1.10.3. Lứa tuối mắc bệnh
Trên thế giới có khoảng 95% trẻ em ở lứa tuổi từ 3 ựến 5 tuổi ựã bị nhiễm RV. Tuy nhiên tỷ lệ nhiễm ở trẻ sơ sinh chưa ựược ựiều tra một cách có hệ thống , nhiễm RV ở trẻ sơ sinh thường không có triệu chứng , tuổi hay gặp nhất của bệnh là trẻ từ 6 ựến 24 tháng tuổi. Nhiễm RV ở người lớn cũng thường không có triệu chứng, ựôi khi biểu hiện thành bệnh, ựặc biệt ở cha mẹ của trẻ bị tiêu chảy do RV [4].
Theo chương trình giám sát ựã công bố năm 2001, sự phân bố bệnh tiêu chảy theo lứa tuổi ở tất cả các lứa tuổi ựều không giống nhau.
Tại Việt Nam trẻ dưới 3 tháng tuổi ắt mắc bệnh do sữa mẹ có tỷ lệ IgA khá cao. Kháng thể này có thể kéo dài tới khi trẻ 2 tuổi, do vậy trẻ bú sữa mẹ ựược miễn dịch tự nhiên nên ắt mắc bệnh hơn.
1.10.4. Miễn dịch
Các loại kháng thể ựóng vai trò trong quá trình bảo vệ là :
- Kháng thể tiết : IgA tiết trong sữa mẹ chiếm tỷ lệ cao và có thể tồn tại ựến 24 tháng, do ựó trẻ bú sữa mẹ ựược bảo vệ trước sự tấn công của RV. Kháng thể trong sữa là kháng thể trung hoà [6]. IgA tiết ở niêm mạc ruột non có vai trò bảo vệ chắnh chống nhiễm RV typ 2. Vì vậy vacxin sử dụng theo ựường uống sẽ tạo miễn dịch cao hơn [8].
- Kháng thể dịch thể : IgM xuất hiện sớm nhất trong máu, cao nhất vào giai ựoạn cấp tắnh của bệnh giảm sau 10 ngày. IgG ựạt mức thấp nhất trong giai ựoạn cấp tắnh và tăng cao ở giai ựoạn phục hồi [8].
Vai trò của miễn dịch trung gian tế bào chưa ựược ựiều tra cụ thể.
1.11. SỰ PHÂN BỐ TOÀN CẦU CÁC CHỦNG RV
Có tổng số 45571 chủng thu thập từ năm 1973 ựến năm 2003 qua 124 công trình nghiên cứu ựược công bố từ năm 1989 ựến năm 2004 từ 52 quốc gia và 5 châu lục. Tất cả chủng này ựã xác ựịnh thuộc typ G, 17996 chủng thuộc typ P và 16474 chủng ựã ựược xác ựịnh vừa thuộc typ G và typ P.
1.11.1. Trên thế giới
Sự phân bố khác nhau của chủng RV ở các vùng khắ hậu khác nhau
- Sự phân bố của các kiểu gen G [2]
+ Theo thống kê tại Nam Mỹ trong 2095 chủng RV ựược phân tắch có 57,5% là G1 ; 18,3% là G2 ; 4,4% là G3 ; 8,8% là G4 ; 2,3% là G5 ; và 8,6% là G9.
+ Tại châu Phi trong 2133 chủng RV ựược phân tắch có G1, G2, G3, G4, G8 và G9 tương ứng là 35,75% ; 20,3% ; 13,3% ; 14,2% ; 12,8 % và 3,7 %.
+ Tại các nước châu Á trong số 13126 chủng phân tắch có tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G10 và G12 tương úng là 60,3% ; 16,7% ; 6,5% ; 14,3% ; 1,7% ; 0,3% ; và 0,2%.
+ Tại Bắc Mỹ trong 2892 chủng RV ựược phân tắch có tỷ lệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là 73,7% ; 11% ; 10,6% ; 2,7% ; 8,6%.
+ Tại châu Âu trong 14475 chủng RV tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G6 và G9 tương ứng là 69.4% ; 10,2% ; 3,5% ; 15,5% ; 0,1% và 1,3%.
+ Tại châu Úc trong 6995 chủng RV ựược phân tắch tỷ kệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là : 74% ; 10,8% ; 1% ; 4,6% và 9,6%.
- Sự phân bố của các kiểu gen P
Kiểu gen P8 và P4 chiếm hơn 90% tiêu chảy do RV . Ngoại trừ ở châu Phi thì kiểu gen P6 có tỷ lệ cao (22,4%) ựứng thứ 2 sau P8 (51%).
- Sự phân bố của các chủng hỗn hợp P-G
Bốn chủng Rota phổ biến trên toàn cầu là P8G1 (64,7%) ; P4G2 (12%) ; P8G3 (3,3%) ; P8G4 (8,5%) chiếm 88,5 % nguyên nhân tiêu chảy ở trẻ em do Rv trên thế giới. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sự phân bố chủng P-G biến ựổi nhanh chóng từ châu lục này tới châu lục khác . Bốn chủng nói trên chiếm tới 90% các trường hợp ở Bắc Mỹ , châu Âu , châu Úc, ở Nam Mỹ và châu Á có mặt khoảng 68% ca nhiễm , ở châu Phi là 50%. Chủng P8G1 gây ra hơn 70% ca nhiễm ở Bắc Mỹ và châu Âu trong khi ựó chỉ xuất hiện trong 30% ca nhiễm ở Nam Mỹ và châu Á, chỉ khoảng 23% ở châu Phi. Trong ựó cần phải kể ựến là sự phát hiện một số chủng P-G bất thường như P4G1, P8G2, P4G3, P4G4 với tần suất tương ựối cao (trong các khu vực khác nhau trên thế giới có thể gợi ý tắnh di truyền bền vững và khả năng tiềm tàng lây lan của chúng trong cộng ựồng).
Sự xuất hiện các chủng bất thường có thể ựược giải thắch bằng các nguyên sau sau ựây [7] :
Genome RV khi sao chép ựã xảy ra ựột biến ựiểm và ựột biến này duy trì trong hạt.
Do sự sắp xếp lại gen. Khi 2 typ huyết thanh cùng gây nhiễm vào một tế bào sẽ xảy ra hoán vị kháng nguyên.
Virus ựộng vật có thể gây nhiễm cho người do ựó làm tăng hoạt tắnh gây nhiễm (ựã có bằng chứng cho thấy ADRV (Animal Derived Rotavirus) nhóm B của người có nguồn gốc từ ựộng vật).
RV gây bệnh mãn tắnh ở người suy giảm miễn dịch có thể sắp xếp lại genome và tạo ra các ựoạn RNA bất thường.
Các yếu tố kể trên có thể cùng một lúc xảy ra. Vắ dụ vừa sắp xếp lại genome, vừa xảy ra ựột biến.
Tần số các mẫu không thể ựịnh typ khi sử dụng phương pháp EIA nằm trong khoảng 8-46,2%, có thể các chủng ựột biến ựã tránh ựược sự nhận biết của các kháng thể ựơn dòng hoặc do sự có mặt của các typ huyết thanh bất thường không phát hiện ựược bởi các kháng thể ựơn dòng vẫn thường ựược sử dụng ựể xác ựịnh RV ở người bằng phương pháp EIA.
Ứng dụng RT-PCR xác ựịnh genome RV ựã làm giảm số lượng các chủng không thể ựịnh typ. Tuy nhiên , những kĩ thuật này còn gặp phải những hạn chế vốn có . Các chủng chứa các ựột biến lớn ở các vùng bám primer vẫn không thể xác ựịnh ựược. Vẫn còn một số nghiên cứu kết hợp EIA và RT-PCR và lai các ựầu dò, tuy vậy khoảng 7,8% - 26,6% các chủng không thể ựịnh typ.
Sự phân bố của các typ P và G dao ựộng theo thời gian
Sự phân bố G và P có sự thay ựổi theo thời gian . Trong nghiên cứu 10 năm liên tiếp (1987-1997) ở Bangladesh cho thấy sự dao ựộng hàng năm là một vắ dụ tiêu biểu sự phân bố của các typ huyết thanh G1, G2, G3, G4 và G9.
- Trong suốt 3 năm ựầu tiên G2 là typ huyết thanh phổ biến nhất, tiếp theo là các typ G1 và G4.
- Năm thứ 4 các typ G4 là phổ biến nhất và chiếm ưu thế ựến năm 1995 . Năm 1995 các typ G9 nổi lên và chiếm ưu thế , các typ G4 hiếm gặp
hơn. Năm 1996 và 1997 typ G9 phổ biến nhất ựược xác ựịnh trong nước này với tần suất tương ứng là 34,4% và 53%.
Như vậy ta thấy các typ P và G của RV trong cùng một khu vực cũng không ổn ựịnh theo các năm, do ựó việc nghiên cứu giám sát tiêu chảy do RV tại các nước là cần thiết ựể có hướng nghiên cứu biện pháp phòng bệnh hợp lý.
1.11.2. Tại Việt Nam
Theo kết quả nghiên cứu tại 6 bệnh viện ở Việt Nam : miền Bắc gồm Bệnh viện Nhi Trung Ương, Bệnh viện Xanh Pôn, Bệnh viện Nhi Hải Phòng . Miền Nam gồm Bệnh viện Nhi Khánh Hoà (Nha Trang), Bệnh viện Nhi đồng I TPHCM, Bệnh viện Nhi đồng II TPHCM thu ựược kết quả sau [18] :
Kiểu gen G : Trong số 221 chủng nghiên cứu từ 7/1998 ựến 6/1999 thu ựược kiểu gen G2 phổ biến nhất (53%), G4 (17%), G1 (13%), G3 (3,6%), G9 (1,3%), kiểu hỗn hợp là 9% và không xác ựịnh là 2,1%.
Kiểu gen P : Trong số 140 chủng nghiên cứu phổ biến nhất 4 chủng là P8 liên kết với G1, G3, G4 và P4G2 tương ứng 74% các chủng lưu hành tại Việt Nam . Ngoài ra còn xác ựịnh 2 chủng với kiểu gen P6 liên kết với G3 và G4.
1.12. CHẨN đOÁN RV 1.12.1. Chẩn ựoán trực tiếp 1.12.1. Chẩn ựoán trực tiếp
- Nuôi cấy xác ựịnh : Có thể nuôi cấy trên tế bào thận của bào thai người, tế bào thận khỉ , tế bào thận bò... Sau ựó phát hiện virus bằng phản ứng trung hoà giảm ựám hoại tử hoặc ELISA... Vịêc nuôi cấy RV trên tế bào còn gặp nhiều khó khăn nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu vì vậy người ta phải dùng các phương pháp khác ựể chẩn ựoán [1,8].
- Kỹ thuật kắnh hiển vi ựiện tử : đây là phương pháp phát hiện trực tiếp RV trong bệnh phẩm và kỹ thuật chẩn ựoán nhanh , ựặc hiệu , tuy nhiên ựộ nhạy không cao và khá ựắt tiền, rất khó thực hiện khi có nhiều mẫu bệnh phẩm [8].
- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp : đây là phương pháp phát hiện virus trong phân, mảnh thiết ruột nhờ kháng thể gắn huỳnh quang [6].
- Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex : Hạt Latex ựược gắn với kháng thể kháng RV ựể chẩn ựoán kháng nguyên của virus . đây là kỹ thuật chấn ựoán nhanh , không cần nhiều trang thiết bị [8].
- Kỹ thuật ựiện di : Nguyên lý các mảnh kép phân tử RNA của RV có trọng lượng phân tử khác nhau nên dễ dàng tách ra khi ựiện di trên gel polyacrylamid hoặc agarose. Kỹ thuật này có ựộ nhạy,ựặc hiệu cao,dễ áp dụng trên nhiều bệnh phẩm [8].
- Kỹ thuật RT Ờ PCR : Kỹ thuật này có giá trị chuẩn ựoán bệnh cao, cho phép xác ựịnh trực tiếp RV trong bệnh phẩm nhờ khả năng khuếch ựại sao chép ngược số lượng các ựoạn RNA ựặc hiệu trên hệ gen của virus [6].
- Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (ELISA) : Phương pháp này dựa vào sự kết hợp giữa kháng thế với kháng nguyên ựể phát hiện kháng nguyên trong phân trẻ em. Kỹ thuật này ựộ nhạy cao, dễ áp dụng khi có nhiều bệnh phẩm Hiện nay kỹ thuật ELISA ựược sử dụng rộng rãi trên thế giới ựể phát hiện RV [6. 8].
1.12.2. Chẩn ựoán gián tiếp
Bằng các kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng RV, gồm : - Phản ứng trung hoà trên tế bào thận khỉ bào thai.
- Phản ứng kết hợp bổ thế : Dùng kháng nguyên là RV ở người tinh khiết, phân lập từ phân bệnh nhân ựể phát hiện RV. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phản ứng ức chế gây nhưng kết hồng cầu thụ ựộng : Có thể dùng phàn ứng này ựể ựịnh lượng IgG, phân biệt ựược lần nhiễm thứ nhất với lần nhiễm thứ hai. Phản ứng này nhạy hơn phản ứng kết hợp bổ thế.
Vì tỷ lệ nhiễm virus ở quần thể dân cư khá cao nên các phương pháp phát hiện kháng thể kháng RV ắt có ý nghĩa chẩn ựoán [12].
1.13. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN VACXIN PHÒNG BỆNH TCC BỆNH TCC
- Ứng cử viên ựầu tiên của vacxin RV là vacxin ựơn giá ỘMonovalent vaccinesỢ sử dụng chủng RV WC3 ựược phân lập từ vật chủ là bò hoặc từ khỉ Rhesus. đây là loại vacxin uống sống giảm ựộc uống một liều duy nhất. Vắc xin này an toàn và có thể ngăn chặn ựược bệnh tiêu chảy do RV ở trẻ em.
- Vacxin thứ hai là các vacxin ựa giá ỘMultivalent vaccinesỢ ựược sản xuất năm 1985 bằng cách sử dụng sự thay thế gen. Một gen trong hệ gen của chủng RV ựộng vật ựược thay thế bởi gen của RV người, gen này mã hoá cho VP7 [4,6].
- Rota Shield là vacxin tứ liên ỘTetravalent vaccinesỢ ựược phát triển bởi chủng RV MMU180006, là vacxin sống giảm ựộc lực uống ựược sản xuất từ chủng RV ở khỉ Rhesus (RRV-TV). Chủng này có cùng ựặc tắnh trung hoà với các chủng RV G3 của người, MMU18006 phù hợp cho việc phát triển vacxin bởi vì nó phát triển tốt trong nuôi cấy tế bào. So với các vacxin dùng các chủng RV bò, MMU 18006 an toàn và tạo miễn dịch tốt. Các thử nghiệm lâm sàng ở trẻ em tại Bắc Mỹ, Nam Mỹ và châu Âu cho thấy RotaShield và vắc xin an toàn và rất hiệu quả. Vắc xin này ựược cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, 600.000 trẻ ựược sử dụng vắc xin tương
ựương với 1,2 triệu liều. Vắc xin này bị ựình chỉ sử dụng vì có liên quan ựến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều ựầu tiên với tỷ lệ ước tắnh 1/10.000 liều.
- Các loại vacxin ựã ựược phê chuẩn sử dụng :
Hội nghị về RV quốc tế lần thứ 6 ựược tổ chức ngày 7,8 tháng 1 năm 2005 tại Mexico ựã thông qua và phê chuẩn 2 vacxin Rota ựó là vắc xin RotaTeq của Meck và vắc xin Rotarix của Smith Line, cả hai loại vắc xin này ựã ựược WHO phê chuẩn sử dụng tháng 1 năm 2006 [4].
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. đối tượng nghiên cứu
- Trẻ em bị tiêu chảy cấp vào viện Nhi Thủy điển năm 2009.
2.1.2. Mẫu bệnh phẩm
1088 mẫu phân của trẻ em từ 0-5 tuổi bị mắc TCC ựiệu trị tại bệnh viện Nhi Thủy điển năm 2009.
2.1.3. Hoá chất, dụng cụ, máy móc dùng cho chẩn ựoán mẫu phân bằng phương pháp ELISA
Hoá chất: Bộ sinh phẩm chẩn ựoán virut rota của hãng DACO bao gồm:
- Chứng dương (lọ 5ml): Chứa virus Rota của Bò ựã bất hoạt (thuộc chủng 3209176) trong ựệm chứa kháng sinh và có màu ựỏ.
- Chứng âm : dung dịch PBS
- Một lọ Conjugate (13ml): chứa kháng thể ựa dòng từ Thỏ liên kết với Enzyme peroxidase của cấy củ cải ngựa hòa tan trong ựệm protein chứa kháng sinh có màu xanh.
- Một lọ dung dịch rửa 50ml (Wash buffer) ựặc 25 lần - Một lọ cơ chất A: chứa ure peroxidase
- Một lọ cơ chất B Substrate TMB (13ml): chứa peroxide và 3,3Ỗ Ờ 5,5Ỗ Ờ tetramethylbenzidine trong ựệm loãng (dung dịch tạo màu)
- Một lọ dung dịch dừng phản ứng 12ml (Stop solution): 0,46 mol/l axit H2SO4
- Giếng nhựa vi lượng có gắn kháng thể ựơn dòng kháng RV. - Giá gắn giếng chuẩn ựộ vi lượng
Dụng cụ làm phản ứng
- Pipet man loại 1000ộm và 200ộm, ựầu côn tương ứng, Eppendoff ml, giá ựựng Eppendoff, máy ựọc ELISA.
- Cồn 900 và bông cồn - Các dụng cụ khác
2.1.4. Nguyên vật liệu sử dụng cho tách chiết RNA từ mẫu phân
- Pipet man (1000ộl, 200ộl, 5 - 50ộl), Eppendoft 1,7ml, giá ựựng, máy vontex, máy ly tâm, bể ổn nhiệt.
- Các ống thu mẫu (collect tube) và cột tách mẫu (spin) - Nước vô trùng, vertrel
- Etanol (96 Ờ 100%) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- AW1, AW2 (ựều thêm ethanol)
- Buffer AVL Ờ RNA carrier, buffer AVE Ờ RNA carrier
Cách pha: n ừ 0,56 ml = x ml
x ừ 10 ộl/ml RNA carrier = y ộl
Với: n = số mẫu tách chiết, x = số ml AVE/AVL cần dùng, y = số ộl AVE Ờ RNA carrier/AVL Ờ RNA carrier
2.1.5 Nguyên vật liệu và hóa chất sử dụng cho quá trình chạy PCR
(Theo chương trình của Australia)
- Dụng cụ chung: Pipet man (1000ộl, 200ộl, 5 - 50ộl), ựầu côn tương ứng, Eppendorf (1,7ml và 0,5ml), giá ựựng eppendotf, khay ựựng ựá,