2.2.1. Dụng cụ vật tư tiêu hao
Các dụng cụ và vật tư cần thiết được sử dụng để thực hiện thí nghiệm trong đề tài được liệt kê trong Bảng 3.
Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài
Ống Falcon 15ml, 50ml
Corning 430791
Corning 430829 www.corning.com Đĩa nuôi cấy tế bào 35x10mm Corning 430165 www.corni ng.com Pipet nhựa 2ml
Pipet nhựa 10ml
Corning 4486
Corning 4488 www.corning.com Pipet thủy tinh 2, 5, 10ml, Trung Quốc
Buồng đếm hồng cầu Thomas – Đức
Bơm tiêm 5ml, 20ml Vinahankook
Bộ đồ mổ Trung Quốc
Cốc đong 50ml, 250ml Trung Quốc
Đĩa petri Trung Quốc
Kim tiêm bướm Việt Nam
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị nghiên cứu cần thiết được sử dụng trong đề tài được liệt kê trong Bảng 4.
Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
Kính hiển vi soi ngược Zeiss Đức
Buồng cấy vô trùng MicroFlow Anh
Tủ lạnh Sanyo Nhật
Máy ly tâm Spectrafuge 6C Labnet Mỹ
Nồi khử trùng Vietronics Việt Nam
Tủ sấy Binder Đức
Bể ổn nhiệt Đài loan Đài loan
Water bath Faalin Đài loan
Máy Cytomic FC 500 Beckman Coulter Mỹ
2.2.3. Hóa chất
Các hóa chất cần thiết được sử dụng trong đề tài được liệt kê trong Bảng 5.
Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài
Tên Mã sản phẩm Website
Dulbecco’s Modified Eagle
Medium (DMEM) Gibco 31600034 www.invitrogen.com Fetal Bovine Serum Gibco 16000044 www.invitrogen.com
L–glutamine Gibco G7513 www.invitrogen.com
Penicillin /Streptomycin Gibco 15140122 www.invitrogen.com Collagenase loại IV Gibco 17104–019 www.invitrogen.com
Trypsin–EDTA Sigma T4799 www.sigmaaldrich.com
PBS Gibco 21600069 www.invitrogen.com
Ampiclin Sigma 11593–027 www.sigmaaldrich.com
Gelatin Stemcell 07903 www.stemcell.com
Xanh trypan Gibco 15250061 www.invitrogen.com
Anti–CD90–FITC BD science – 555595 www.bdbiosciences.com Anti–CD73–PE BD science – 550257 www.bdbiosciences.com Anti–CD34–PE BD science – ¿??? www.bdbiosciences.com Mouse IgG FITC BD science – 349041 www.bdbiosciences.com Mouse IgG–PE BD science – 64999 www.bdbiosciences.com
Dung dịch Ringer Việt Nam
Clorox Goodmaid (Malaysia)
2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy tế bào
Thành phần, nồng độ của các dung dịch enzyme và môi trường sử dụng trong thí nghiệm, được liệt kê trong Bảng 6 và Bảng 7.
Bảng 6. Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào
STT Tên Nồng độ cuối cùng
1 FBS 10% (v/v)
2 L–glutamine 2mM
3 Penicillin/Streptomycin 100µg/ml Streptomycin100U/ml Penicillin, 4 DMEM Thêm vào cho đủ lượng cần pha và bảo quản ở 40C
2.2.3.2. Các dung dịch Enzyme
Bảng 7. Nồng độ của các dung dịch enzyme
STT Tên Nồng độ cuối cùng
1 Collagenase 0,1% (w/v)
2 Trypsin/EDTA Trypsin 0,25% / EDTA 0,025% (w/v)
2.2.3.3. Các dung dịch khác
• Dung dịch vận chuyển: PBS + Ampicilin 200µg/ml • Dung dịch PBS (pH 7,2–7,4)
• Gelatin 0,1% (w/v) • Xanh trypan 0,4% (v/v) • Muối Ringer 0,9% (v/v)
2.3.1. Quy trình thí nghiệm
Quy trình thí nghiệm được chúng tôi thực hiện như sau (Hình 7): dây rốn sau khi vận chuyển từ bệnh viện về sẽ được sử dụng để phân lập MSC. Sau 2 ngày phân lập và nuôi cấy thu được quần thể tế bào. Trong nuôi cấy nguyên phát, chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy tế bào chỉ thích hợp cho MSC phát triển (không thích hợp cho tế bào nội mô), cấy tế bào với mật độ thưa nhằm loại bỏ tế bào nội mô khỏi hỗn hợp tế bào. Sau 16 ngày nuôi cấy thu được quần thể MSC có độ thuần nhất cao. Tiếp tục duy trì quần thể tế bào sau 40 ngày nuôi cấy. Để đánh giá độ thuần nhất của quần thể tế bào ở từng giai đoạn sau 2 ngày, 16 ngày, 40 ngày tiến hành phân tích bằng phương pháp Flow cytometry.
Hình 7. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm
2.3.2. Thu nhận dây rốn
Chuẩn bị dung dịch vận chuyển gồm PBS có bổ sung ampicilin nồng độ cuối cùng là 100µg/ml. Dung dịch vận chuyển được bảo quản ở nhiệt độ 40C.
Dây rốn được thu nhận ngay khi đứa trẻ vừa mới sinh ra, sau đó được đưa ngay vào trong dung dịch vận chuyển và giữ ở nhiệt độ 4oC cho đến khi tiến hành phân lập (dây rốn chỉ được giữ ở nhiệt độ 4oC tối đa đến 4–5 h sau khi thu nhận).
Ở ngoài buồng nuôi cấy, thực hiện ba bước sau:
Hình 8. Rửa bề mặt dây rốn bằng dung dịch muối Ringer
• Đặt chai dung dịch muối Ringer 0,9% trong Water bath ở 37o C. • Dây rốn được ngâm trong dung dịch tẩy rửa 1–2 phút.
• Rửa sạch bề mặt dây rốn bằng dung dịch muối Ringer từ 2–3 lần (Hình 8). • Xác định vị trí tĩnh mạch. Sử dụng kim tiêm bướm để bơm 30–50ml dung
dịch muối Ringer 0,9% vào mặt trong của tĩnh mạch. Từ các bước sau, thực hiện trong buồng cấy vô trùng:
• Phủ đĩa nuôi cấy bằng 1 lớp gelatin
• Rửa lại mặt trong của tĩnh mạch dây rốn 2 lần bằng PBS.
• Pha dung dịch collagenase 0,1% vừa đủ với lượng dây rốn thu được. • Bơm dung dịch collagenase 0,1% vào tĩnh mạch dây rốn (Hình 8).
Hình 9. Bơm Collagenase vào trong tĩnh mạch dây rốn
• Đặt dây rốn vào cốc đong có chứa dung dịch Ringer đã chuẩn bị trước đó trong bể ổn nhiệt. Ủ dây rốn trong dung dịch Ringer ở 37oC trong 15 phút
Hình 10. Ủ dây rốn trong dung dịch Ringer ở 370C
Hình 11. Mát – xa dây rốn
• Sau đó, thu lấy phần dung dịch collagenase (có chứa tế bào bị bong ra). Li tâm ở 1200g trong vòng 10 phút.
• Loại bỏ dịch nổi sau đó huyền phù hóa tế bào ở đáy ống Falcon.
• Chuyển dịch huyền phù tế bào vào trong các đĩa nuôi cấy 35mm đã được phủ gelatin.
• Thêm môi trường nuôi cấy tế bào cho đủ 2,5ml môi trường ở mỗi đĩa nuôi cấy.
• Nuôi cấy tế bào trong tủ ấm 37oC có 5%CO2, độ ẩm 95%
2.3.4. Phương pháp phủ gelatin lên bề mặt nuôi cấy
• Dùng pipette hút một lượng gelatin vừa đủ vào đĩa nuôi cấy, sao cho dung dịch gelatin trải đều trên mặt đĩa (thông thường với 1 đĩa nuôi cấy 35mm cần 0,8ml dung dịch gelatin), đặt đĩa nuôi cấy trong tủ ấm
• Sau 30 phút, hút bỏ dung dịch gelatin
• Mở nắp đĩa nuôi cấy trong buồng cấy vô trùng cho đến khi bề mặt đĩa khô hoàn toàn
• Đậy nắp đĩa nuôi cấy lại. Đĩa gelatin có thể được cất giữ và sử dụng trong khoảng 7 ngày ở nhiệt độ thường
• Trước khi cho dịch huyền phù tế bào vào trong các đĩa nuôi cấy, lấy ra 10µl dịch huyền phù để đếm tế bào
• Sau đó, chia đều dịch huyền phù tế bào vào trong các đĩa sao cho mật độ tế bào đạt 105 tế bào /ml
• Thay một nửa môi trường sau 1 ngày phân lập và thay toàn bộ môi trường sau 2 ngày phân lập
• Thay môi trường nuôi cấy tế bào (cũng là môi trường chọn lọc MSC) 2 ngày 1 lần
• Khi tế bào đạt độ che phủ 90% bề mặt đĩa nuôi cấy thì tiến hành cấy chuyển
2.3.6. Phương pháp cấy chuyển tế bào
• Làm ấm Trypsin – EDTA, môi trường nuôi cấy tế bào và PBS đến 37oC • Hút bỏ môi trường cũ
• Rửa đĩa nuôi cấy bằng PBS trong 2 lần
• Thêm 0,4ml Trypsin – EDTA sao cho enzyme phủ đều bề mặt đĩa nuôi cấy. Vỗ nhẹ vào đĩa nuôi cấy cho đến khi tế bào tách khỏi bề mặt
• Thêm 0,8ml môi trường nuôi cấy tế bào để bất hoạt trysin
• Chia đều huyền phù tế bào sang các đĩa nuôi cấy mới đã phủ sẵn gelatin. • Thêm môi trường vào các đĩa nuôi cấy sao cho đủ 1,5ml mỗi đĩa nuôi cấy
2.3.7. Phương pháp phân tích tế bào bằng Flow Cytometry
• Xử lý tế bào bằng Trypsin.
• Li tâm ở 1200g trong vòng 10 phút.
• Loại bỏ dịch nổi. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS • Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.
• Huyền phù hóa tế bào ở đáy bằng PBS sao cho nồng độ cuối cùng đạt 1 x 105 tế bào/ml
• Ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút với các kháng thể CD34–PE, CD73–PE, CD90–FITC.
• Song song với quá trình này, MSC được ủ với kháng thể không tương thích IgG chuột gắn FITC để làm đối chứng âm nhằm loại trừ các tế bào liên kết không đặc hiệu khi đếm.
• Các mẫu tế bào được phân tích trên máy Cytomic FC500 hãng Beckman Couter
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Dây rốn vận chuyển từ bệnh viện được đưa ngay vào phòng thí nghiệm nuôi cấy để phân lập tế bào. Đầu tiên, dây rốn được ngâm trong dung dịch tẩy rửa 1–2 phút, sau đó được rửa bên ngoài bằng nước muối sinh lý 2–3 lần. Một đầu của dây rốn được luồn đầu kim dạng bướm vào tĩnh mạch và kẹp chặt. Sử dụng một xy lanh loại 20ml bơm PBS để rửa sạch tĩnh mạch. Đầu còn lại của dây rốn được kẹp chặt và tiến hành bơm collagenase type IV (Gibco) nồng độ 0,1% qua kim bướm vào đầy tĩnh mạch. Sau khi ủ 20 phút ở 37oC tiến hành mát xa và thu dung dịch collagenase có chứa tế bào bị bong ra vào một ống Falcon (có thể rửa lại tĩnh mạch dây rốn bằng PBS để thu được lượng tế bào nhiều hơn). Huyền phù tế bào được ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 10. Tế bào lúc này được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc chỉ thích hợp cho tế bào gốc trung mô sinh trưởng, không thích hợp cho các tế bào không phải là tế bào gốc trung mô như các tế bào nội mô, các tế bào cơ biểu mô và các dạng tế bào khác.
Cụ thể môi trường nuôi cấy chọn lọc MSC không có VEGF (là nhân tố kích thích sinh trưởng kích thích sự tăng sinh của tế bào nội mô). Môi trường cơ bản là M199 được thay bằng DMEM–LG, ít chất dinh dưỡng hơn. Mặt khác nồng độ FBS (10%) cũng thấp hơn so với nồng độ FBS được sử dụng khi nuôi cấy tế bào nội mô (20%). Tất cả những thay đổi trên đều không thuận lợi cho sự tăng sinh của tế bào nội mô mà thuận lợi cho sự phát triển của MSC. Các tế bào được cấy ở nồng độ 1x105tế bào/ml và được nuôi cấy trên các đĩa nuôi cấy. Chúng tôi tiến hành phân lập và nuôi cấy như trên sẽ thu được quần thể MSC thuần nhất, đồng thời đánh giá sự thay đổi về tỉ lệ của quần thể tế bào ở từng giai đoạn sau khi phân lập.
3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY NGUYÊN PHÁT QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY NGUYÊN PHÁT
3.1.1. Kết quả phân lập và đánh giá độ thuần nhất của quần thể tế bào khi mới được phân lập được phân lập
Sau 2 ngày nuôi cấy, môi trường được thay toàn bộ lần đầu tiên để loại bỏ tất cả các tế bào không bám dính. Có 2 loại tế bào bám dính xuống bề mặt đĩa nuôi cấy có thể quan sát thấy (Hình 12):
(i) Dạng thứ nhất là những tế bào nội mô sinh trưởng tạo thành lớp đơn. Chúng có kích thước lớn hơn tế bào trung mô, hình đa giác với 1 nhân hình ô van nằm ở trung tâm. Thường không phân biệt được ranh giới giữa các tế bào. Các tế bào nội mô mỏng và phẳng. Dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại lớn có thể nhìn thấy tế bào chất của tế bào nội mô có rất nhiều hạt (Hình 12– mũi tên đen). Theo Jaffe và cộng sự thì chúng là các túi tiết tế bào chất hay các thể hình ô van hoặc hình que [20].
(ii) Dạng còn lại là tế bào gốc trung mô có kích thước nhỏ hơn tế bào nội mô, hình dạng thuôn dài giống như các nguyên bào sợi trong nuôi cấy. Do xung quanh hạch nhân có chứa các nhiễm sắc chất được phân tán đều đặn nên có thể dễ dàng quan sát thấy nhân của tế bào trung mô to và tròn (Hình 12 – mũi tên trắng).
Hình 12. Tế bào 2 ngày nuôi cấy in vitro sau khi phân lập Mũi tên trắng: Tế bào dạng MSC hình thoi giống nguyên bào sợi;
Mũi tên đen: Tế bào dạng nội mô bám thành từng cụm có kích thước nhỏ, hình đa giác và dẹt. (Độ phóng đại 10x20)
Có thể quan sát thấy sau 2 ngày phân lập và nuôi cấy, quần thể tế bào dạng nguyên bào sợi được cho là MSC có tỉ lệ khá ít trong quần thể ban đầu khi mới phân lập. Để đánh giá tỉ lệ MSC có trong quần thể tế bào ban đầu khi mới được phân lập để thấy sự thay đổi sau thời gian nuôi cấy, chọn lọc MSC. Chúng tôi tiến hành phân tích
quần thể tế bào bằng phương pháp Flow cytometry sử dụng marker âm tính là CD34, marker dương tính là CD73 và CD90 (Hình 13).
Hình 13. Kết quả phân tích quần thể tế bào phân lập từ lớp lót tĩnh mạch bằng phương pháp dòng chảy tế bào
Các tế bào hầu như không có hiện tượng tự phát huỳnh quang ở các bước sóng sử dụng để phân tích (ĐC); Tỷ lệ tế bào dương tính với marker CD34 khá cao do tế bào nội mô chiếm đa số trong quần thể (CD34); Tỷ lệ tế bào dương tính với CD90 khá thấp (CD90); Tỷ lệ tế bào dương tính với CD73 tương đối cao (CD73).
Kết quả phân tích Flow Cytometry cho thấy rằng, ở lô đối chứng các tế bào không tạo nhiễu huỳnh quang khi không được xử lý gắn kháng thể và không tạo liên
kết không đặc hiệu khi ủ với kháng thể kháng IgG chuột (kết quả không thể hiện). Tỷ lệ tế bào dương tính với CD34 khá cao, chiếm 45,6%. Đây là một marker của các tế bào gốc dòng máu, tuy nhiên, tế bào nội mô mạch máu dây rốn khi mới phân lập được cũng biểu hiện marker [6, 31]. Điều này cho thấy sự hiện diện của tế bào nội mô trong quần thể tế bào sau khi phân lập là khá cao. Để định lượng chính xác tỷ lệ quần thể tế bào nội mô ở đây ta cần phải sử dụng thêm các marker dương tính với chúng. Tuy nhiên nghiên cứu này chúng tôi tập trung vào loại tế bào có tiềm năng ứng dụng cao hơn là tế bào gốc trung mô. Đối với các marker dương tính với tế bào gốc trung mô là CD73, CD90 thì tỷ lệ này chiếm lần lượt là (71%) và (15,1%). Trong khi tỷ lệ tế bào dương tính với với CD73 là khá cao thì đối với CD90 lại khá thấp. Như vậy là có một quần thể tế bào biểu hiện CD73 nhưng không biểu hiện CD90. Chính vì đặc điểm này mà khi xác định đặc tính của một dòng tế bào bất kỳ người ta luôn kết hợp nhiểu marker. Kết hợp cùng với kết quả phân tích biểu hiện đối với CD90, chúng tôi có thể khẳng định được MSC có thể chỉ chiếm một tỷ lệ rất thấp và quần thể tế bào ở giai đoạn này vẫn còn hỗn tạp nhiều loại tế bào khác nhau. Để nghiên cứu sự thay đổi tỷ lệ MSC trong quần thể chúng tôi tiến hành nuôi cấy chọn lọc và tiếp tục phân tích Flow cytometry.
3.1.2. Kết quả nuôi cấy chọn lọc quần thể tế bào.
Do trong môi trường nuôi cấy không có VEGF (là nhân tố sinh trưởng kích thích tăng sinh của tế bào nội mô) nên các tế bào nội mô trong đĩa nuôi cấy chết dần dần trong khoảng từ 7 đến 14 ngày. Sau khoảng 1 tuần, có thể thấy được các tế bào gốc trung mô xuất hiện rõ ràng hơn, với số lượng lớn hơn so với lúc ban đầu, trong khi đó số lượng các tế bào nội mô thì giảm đi rõ rệt. Có thể dễ dàng nhận thấy các tế bào thuôn dài, có hình dạng giống nguyên bào sợi chiếm đã phát triển mạnh hơn và chiếm ưu thế. Trong khi quần thể tế bào nội mô có hình dạng đa giác lại nhỏ và giảm dần đi thành các đảo tế bào (Hình 14).
Hình 14. Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy chọn lọc dòng tế bào gốc
Các tế bào gốc trung mô (có dạng thuôn dài, hình dạng giống nguyên bào sợi) xuất hiện rõ ràng hơn, với số lượng lớn hơn. Trong khi đó các tế bào nội mô (có hình dạng đa giác nhỏ) giảm đi rõ rệt và thành các đảo tế bào. Độ phóng đại 5x10.
Sau 2 tuần nuôi cấy, trong điều kiện không có nhân tố sinh trưởng VEGF, các tế bào nội mô gần như biến mất hoàn toàn, chỉ còn lại các tế bào có hình dạng giống nguyên bào sợi sống sót, tăng sinh và hình thành các quần lạc (colony). Lúc này, tế bào gốc trung mô có tiềm năng sinh sản rất lớn, tăng sinh rất nhanh so với giai đoạn 7 ngày