Các nghiên cứu về tế bào gốc trung mô chứng minh được rằng quần thể tế bào gốc trung mô thu nhận từ dây rốn có khẳ năng duy trì từ 6 đến 20 lần cấy chuyển với khoảng 20 đến 50 lần nhân đôi quần thể vẫn giữ được những đặc tính đặc trưng của một dòng tế bào gốc. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng tiến hành chứng minh quần thể tế bào gốc trung mô phân lập từ lớp lót trong tĩnh mạch dây rốn có khả năng duy trì nhân lên lâu dài trong phòng thí nghiệm mà vẫn giữ được các đặc điểm về hình thái, khả năng tăng sinh cũng như sự biểu hiện một số marker đặc trưng.
Sau khoảng 40 ngày nuôi cấy với 6 lần cấy chuyển và khoảng 20 lần nhân đôi quần thể, chúng tôi nhận thấy các tế bào gốc trung mô vẫn duy trì được hình thái đặc trưng và khả năng tăng sinh. Bằng chứng là chúng vẫn có hình thái dài, thuôn nhọn ở hai đầu và sinh trưởng thành từng quần lạc khi đạt được mật độ cao. Về khả năng tăng sinh, chúng vẫn duy trì thời gian cấy chuyển 2–3 lần một ngày tùy thuộc vào mật độ của mỗi lần cấy chuyển (Hình 18).
Hình 18. Quần lạc tế bào gốc trung mô sau 40 ngày nuôi cấy
Sau khoảng 40 ngày nuôi cấy, 6 lần cấy chuyển với khoảng 20 lần nhân đôi quần thể, các tế bào gốc trung mô vẫn duy trì được hình thái đặc trưng và khả năng tăng sinh. Chúng vẫn có hình thái dài, thuôn nhọn ở hai đầu và sinh trưởng thành từng quần lạc khi đạt được mật độ cao. Độ phóng đại 5x10.
Như vậy quần thể tế bào gốc trung mô duy trì sau 40 ngày nuôi cấy vẫn không thay đổi về hình thái cũng như khả năng tăng sinh. Để chứng minh MSC không thay
đổi sự biểu hiện các marker đặc trưng sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro chúng tôi tiếp tục tiến hành đánh giá khả năng biểu hiện của CD90 và CD73. Marker CD34 vẫn được sử dụng nhằm loại bỏ khả năng còn sót lại của tế bào nội mô.
Kết quả phân tích Flow Cytometry được minh họa ở Hình 19. Tỷ lệ tế bào dương tính với CD34 không đáng kể (1,7%). Lượng tế bào dương tính với CD90 chiếm tới 99,5%, nghĩa là gần như tuyệt đại đa số tế bào đều dương tính với marker này. Với marker CD73, kết quả cũng tương tự như CD90 (99,2%). Kết quả này chứng tỏ sự thuần nhất rất cao của quần thể. Như vậy, sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro các tế bào gốc trung mô vẫn giữ được các đặc tính về hình thái, khả năng tăng sinh mạnh cũng như sự biểu hiện các marker đặc trưng. Cho đến nay dòng tế bào này đã được chúng tôi duy trì đến 12 lần cấy chuyển với khoảng 36 lần nhân đôi quần thể mà chưa có dấu hiệu thay đổi về hình thái cũng như khả năng nhân lên in vitro.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
• Đã phân lập và nuôi cấy thành công MSC từ lớp lót trong tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh.
• Thu được quần thể MSC có hình thái tương đối đồng nhất sau 2–3 tuần nuôi cấy chọn lọc, quần thể này âm tính với marker của tế bào dòng máu CD34 và dương tính với các marker của tế bào gốc trung mô là CD90 và CD73 với tỷ lệ rất cao.
• Duy trì được quần thể MSC sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro mà vẫn giữ được các đặc tính của MSC.
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả thu được, chúng tôi đưa ra những kiến nghị sau:
• Tiếp tục theo dõi và duy trì dòng tế bào gốc trung mô phân lập được qua các lần cấy chuyển.
• Thử nghiệm biệt hóa MSC thành các tế bào chuyên hóa để chứng minh tính đa tiềm năng của chúng.
• Thử nghiệm chuyển gen trị liệu một số bệnh vào MSC và tiến hành cấy ghép trên mô hình động vật.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009), Công nghệ Tế bào gốc, NXB Giáo dục Việt Nam.
2. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trần Lê Bảo Hà (2007), Thu nhận và biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu dây rốn người, ĐH Quốc gia TP.HCM, 10(12), trang 05–10.
3. Mai Mạnh Tuấn, Chu Quốc Trường, Trần Thanh Loan, Bùi Thị Nga, Nguyễn Thông, Phan Toàn Thắng (2007), “Kết quả bước đầu sử dụng tế bào gốc trung mô dây rốn trong điều trị vết thương”, TC Nghiên cứu y dược học cổ truyền Việt Nam, 18, trang 27–33.
4. Phạm Thúy Trinh, Trương Định, Trương Thị Thu Huyền, Phạm Văn Phúc, Đỗ Minh Trung, Lê Văn Đông (2010), “Nghiên cứu phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh”, Tạp trí Thông tin Y dược, trang 1–6.
Tài liệu tiếng Anh
5. Barry F.P. and Murphy J.M. (2004), “Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36 (4), pp. 568–584.
6. Baudin B., Bruneel A., Bosselut N., and Vaubourdolle M. (2007), “A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells”, Nat. Protocols, 2 (3), pp. 481–485.
7. Bianchi G., Banfi A., et al. (2003), “Ex vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2”, Experimental Cell Research, 287 (1), pp. 98–105.
8. Bigos M., Baumgarth N., and Jager G.C. (1999), “Nine color eleven parameter immunophenotyping using three laser Flow cytometry”, Cytometry, 36, pp. 36– 45.
9. Bobis S., Jarocha D., and Majka M. (2006), “Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications.” Folia Histochem Cytobio, 44 (4), pp. 215–230.
10. Brunsting A. and Mullaney P.F. (1994), “Differential light scattering from mammalian cells”, Biophys. J, 14, pp. 439–453.
11. Campagnoli C., Roberts I.A.G., Kumar S., Bennett P.R., Bellantuono I., and Fisk N.M. (2001), “Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first–trimester fetal blood, liver, and bone marrow”, Blood, 98 (8), pp. 2396–2402.
12. Caplan A.I. (2007), “Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine”, Journal of Cellular Physiology, 213 (2), pp. 341–347.
13. Chopp M. and Li Y. (2002), “Treatment of neural injury with marrow stromal cells”, The Lancet Neurology, 1 (2), pp. 92–100.
14. Colter D.C., Sekiya I., and Prockop D.J. (2001), “Identification of a subpopulation of rapidly self–renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 98 (14), pp. 7841–7845.
15. Conget P.A. and Minguell J.J. (1999), “Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells”, Journal of Cellular Physiology, 181 (1), pp. 67–73.
16. Coulter W.H. (1956), “High speed automatic blood cell counter and analyzer”,
Proc. Natl. Electronics Conf, 12, pp. 1034–1040.
17. Covas D., Siufi J., Silva A., and Orellana M. (2003), “Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells.” Braz J Med Biol Res, 36 (9), pp. 1179– 1183.
18. Crosland–Taylor P.J. (1953), “A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube”, Nature, 171, pp. 37–38.
19. Dennis J., Carbillet J., Caplan A., and Charbord P. (2002), “The STRO–1+ marrow cell population is multipotential”, Cells Tissues Organs, 170 (2–3), pp. 73–82.
20. Eric E. Jaffe R.L.N., G.Becker C., and Minick C.R. (1973), “Culture of human endothelial cells derived from umbilical vein”, Journal of clinical investigation, 52, pp. 235–242.
21. Erices A., Conget P., and Minguell J.J. (2000), “Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood”, British Journal of Haematology, 109 (1), pp. 235–242.
22. Fibbe W.E. and Noort W.A. (2003), “Mesenchymal Stem Cells and Hematopoietic Stem Cell Transplantation”, Annals of the New York Academy of Sciences, 996 (1), pp. 235–244.
23. Fisher J.P., Sémont A., et al. (2007), “Mesenchymal Stem Cells Increase Self– Renewal of Small Intestinal Epithelium and Accelerate Structural Recovery after Radiation Injury”, in Tissue Engineering, Springer US, pp. 19–30.
24. Friedenstein A.J., Piatetzky–Shapiro I.I., and Petrakova K.V. (1966), “Osteogenesis in transplants of bone marrow cells”, Journal of Embryology and Experimental Morphology, 16 (3), pp. 381–390.
25. Fulwyler M.J. (1965), “Electronic separation of biological cells by volume”,
Science, 150, pp. 910–912.
26. Gelse K., Von Der Mark K., Aigner T., Park J., and Schneider H. (2003), “Articular cartilage repair by gene therapy using growth factor–producing mesenchymal cells”, Arthritis & Rheumatism, 48 (2), pp. 430–441.
27. Ghannam S., Bouffi C., Djouad F., Jorgensen C., and Noël D. (2010), “Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications.” Stem Cell Res Ther, 1 (1), pp. 2.
28. In 'T Anker P., Noort W., et al. (2003), “Mesenchymal stem cells in human second–trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar
immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentiation potential”,
Haematologica, 88 (8), pp. 845–851.
29. In 'T Anker P.S., Scherjon S.A., et al. (2004), “Isolation of Mesenchymal Stem Cells of Fetal or Maternal Origin from Human Placenta”, STEM CELLS, 22 (7), pp. 1338–1345.
30. Jiang Y., Jahagirdar B.N., et al. (2002), “Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow”, Nature, 418 (6893), pp. 41–49.
31. Kadam S., Tiwari S., and Bhonde R. (2009), “Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord”,
In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal, 45 (1), pp. 23–27– 27.
32. Kadivar M., Khatami S., Mortazavi Y., Shokrgozar M.A., Taghikhani M., and Soleimani M. (2006), “In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein–derived mesenchymal stem cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 340 (2), pp. 639–647.
33. Kamentsky L.A., Melamed M.R., and Derman H. (1965), “Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis”, Science, 150, pp. 630–631.
34. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., Shang H., and Ogle R.C. (2005), “Cell Surface and Transcriptional Characterization of Human Adipose–Derived Adherent Stromal (hADAS) Cells”, STEM CELLS, 23 (3), pp. 412–423.
35. Kestendjieva S., Kyurkchiev D., et al. (2008), “Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord”, Cell Biol Int., 32 (7), pp. 724–732.
36. Kim J., Kang J., et al. (2009), “Biological characterization of long–term cultured human mesenchymal stem cells”, Archives of Pharmacal Research, 32 (1), pp. 117–126–126.
37. Levičar N., Habib N.A., Gordon M.Y., and Dimarakis I. (2008), Stem cell repair and regeneration, The Hammersmith, ed. 3, Vol. 3, Imperial College Press pp.733–744.
38. Majors A.K., Boehm C.A., Nitto H., Midura R.J., and Muschler G.F. (1997), “Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation”, Journal of Orthopaedic Research, 15 (4), pp. 546– 557.
39. Minguell J., Conget P., and Erices A. (2000), “Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells”, Braz J Med Biol Res, 33 (8), pp. 881–887.
40. Nathan S., De S.D., Thambyah A., Fen C., Goh J., and Lee E.H. (2003), “Cell– Based Therapy in the Repair of Osteochondral Defects: A Novel Use for Adipose Tissue”, Tissue Engineering, 9 (4), pp. 733–744.
41. Payushina O., Domaratskaya E., and Starostin V. (2006), “Mesenchymal stem cells: Sources, phenotype, and differentiation potential”, Biology Bulletin, 33 (1), pp. 2–18–18.
42. Pittenger M.F., Mackay A.M., et al. (1999), “Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells”, Science, 284 (5411), pp. 143–147.
43. Pivoriunas A., Bernotiene E., Unguryte A., Valiuniene S., Drasutiene G., and Venalis A. (2006), “Isolation and differentiation of mesenchymal–like cells from human umbilical cord vein endothelium and subendothelium”,
BIOLOGLIA, 2, pp. 99–103.
44. Pomerance J. (2002), Journal of Perinatology, Vol. 22 pp.504–505.
45. R. Lanza R.L. and Vacanti J. (2007), Principles of tissue engineering, 3th edition, Academic press.
46. Raff M. (2003), “ADULT STEM CELL PLASTICITY: Fact or Artifact?”
47. Rebelatto C.K., Aguiar A.M., et al. (2008), “Dissimilar Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, and Adipose Tissue”, Experimental Biology and Medicine, 233 (7), pp. 901–913. 48. Reyes M., Lund T., Lenvik T., Aguiar D., Koodie L., and Verfaillie C.M.
(2001), “Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells”, Blood, 98 (9), pp. 2615–2625.
49. Rhodes N., Srivastava J., Smith R., and Longinotti C. (2004), “Heterogeneity in proliferative potential of ovine mesenchymal stem cell colonies”, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 15 (4), pp. 397–402–402.
50. Romanov Y.A., Svintsitskaya V.A., and Smirnov V.N. (2003), “Searching for Alternative Sources of Postnatal Human Mesenchymal Stem Cells: Candidate MSC–Like Cells from Umbilical Cord”, STEM CELLS, 21 (1), pp. 105–110. 51. Roufosse C.A., Direkze N.C., Otto W.R., and Wright N.A. (2004), “Circulating
mesenchymal stem cells”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36 (4), pp. 585–597.
52. Sarugaser R., Hanoun L., Keating A., Stanford W.L., and Davies J.E. (2009), “Human Mesenchymal Stem Cells Self–Renew and Differentiate According to a Deterministic Hierarchy”, PLoS ONE, 4 (8), pp. e6498.
53. Song L. and Tuan R.S. (2004), “Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow”, The FASEB Journal. 54. Thompson W. (1967), “On a self–acting apparatus for multiplying and
maintaining electric charges with applications to illustrate the voltaic theory”,
Proc. R. Soc. Lond, 16, pp. 67–72.
55. Toai T., Thao H., et al. (2009), “In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood”, Cell and Tissue Banking, 11 (3), pp. 269–280–280.
56. Tomita S., Li R.–K., et al. (1999), “Autologous Transplantation of Bone Marrow Cells Improves Damaged Heart Function”, Circulation, 100 (90002), pp. II–247–256.
57. Tropel P., Noël D., Platet N., Legrand P., Benabid A.–L., and Berger F. (2004), “Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow”, Experimental Cell Research, 295 (2), pp. 395–406.
58. Troyer D.L. and Weiss M.L. (2008), “Concise Review: Wharton's Jelly–Derived Cells Are a Primitive Stromal Cell Population”, STEM CELLS, 26 (3), pp. 591– 599.
59. Tsuchiya H., Kitoh H., Sugiura F., and Ishiguro N. (2003), “Chondrogenesis enhanced by overexpression of sox9 gene in mouse bone marrow–derived mesenchymal stem cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 301 (2), pp. 338–343.
60. Undale A.H., Westendorf J.J., Yaszemski M.J., and Khosla S. (2009), “Mesenchymal Stem Cells for Bone Repair and Metabolic Bone Diseases”,
Mayo Clinic Proceedings, 84 (10), pp. 893–902.
61. Van Beuningen H.M., Glansbeek H.L., Van Der Kraan P.M., and Van Den Berg W.B. (1998), “Differential effects of local application of BMP–2 or TGF– [beta]1 on both articular cartilage composition and osteophyte formation”,
Osteoarthritis and Cartilage, 6 (5), pp. 306–317.
62. Verfaillie C.M. (2002), “Adult stem cells: assessing the case for pluripotency”,
Trends in Cell Biology, 12 (11), pp. 502–508.
63. Wagers A.J. and Weissman I.L. (2004), “Plasticity of Adult Stem Cells”, Cell, 116 (5), pp. 639–648.
64. Wagner W., Wein F., et al. (2005), “Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood”, Experimental hematology, 33 (11), pp. 1402–1416.
65. Wakitani S., Goto T., et al. (1994), “Mesenchymal cell–based repair of large, full–thickness defects of articular cartilage.” J Bone Joint Surg Am, 76 (4), pp. 579–592.
66. Wang J.–S., Shum–Tim D., Galipeau J., Chedrawy E., Eliopoulos N., and Chiu R.C.J. (2000), “Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: Feasibility and potential clinical advantages”, The Journal of thoracic and cardiovascular surgery, 120 (5), pp. 999–1006.
67. Watson J.V. (1999), “The early fluidic and optical physics of cytometry.”