• Xử lý tế bào bằng Trypsin.
• Li tâm ở 1200g trong vòng 10 phút.
• Loại bỏ dịch nổi. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS • Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.
• Huyền phù hóa tế bào ở đáy bằng PBS sao cho nồng độ cuối cùng đạt 1 x 105 tế bào/ml
• Ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút với các kháng thể CD34–PE, CD73–PE, CD90–FITC.
• Song song với quá trình này, MSC được ủ với kháng thể không tương thích IgG chuột gắn FITC để làm đối chứng âm nhằm loại trừ các tế bào liên kết không đặc hiệu khi đếm.
• Các mẫu tế bào được phân tích trên máy Cytomic FC500 hãng Beckman Couter
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Dây rốn vận chuyển từ bệnh viện được đưa ngay vào phòng thí nghiệm nuôi cấy để phân lập tế bào. Đầu tiên, dây rốn được ngâm trong dung dịch tẩy rửa 1–2 phút, sau đó được rửa bên ngoài bằng nước muối sinh lý 2–3 lần. Một đầu của dây rốn được luồn đầu kim dạng bướm vào tĩnh mạch và kẹp chặt. Sử dụng một xy lanh loại 20ml bơm PBS để rửa sạch tĩnh mạch. Đầu còn lại của dây rốn được kẹp chặt và tiến hành bơm collagenase type IV (Gibco) nồng độ 0,1% qua kim bướm vào đầy tĩnh mạch. Sau khi ủ 20 phút ở 37oC tiến hành mát xa và thu dung dịch collagenase có chứa tế bào bị bong ra vào một ống Falcon (có thể rửa lại tĩnh mạch dây rốn bằng PBS để thu được lượng tế bào nhiều hơn). Huyền phù tế bào được ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 10. Tế bào lúc này được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc chỉ thích hợp cho tế bào gốc trung mô sinh trưởng, không thích hợp cho các tế bào không phải là tế bào gốc trung mô như các tế bào nội mô, các tế bào cơ biểu mô và các dạng tế bào khác.
Cụ thể môi trường nuôi cấy chọn lọc MSC không có VEGF (là nhân tố kích thích sinh trưởng kích thích sự tăng sinh của tế bào nội mô). Môi trường cơ bản là M199 được thay bằng DMEM–LG, ít chất dinh dưỡng hơn. Mặt khác nồng độ FBS (10%) cũng thấp hơn so với nồng độ FBS được sử dụng khi nuôi cấy tế bào nội mô (20%). Tất cả những thay đổi trên đều không thuận lợi cho sự tăng sinh của tế bào nội mô mà thuận lợi cho sự phát triển của MSC. Các tế bào được cấy ở nồng độ 1x105tế bào/ml và được nuôi cấy trên các đĩa nuôi cấy. Chúng tôi tiến hành phân lập và nuôi cấy như trên sẽ thu được quần thể MSC thuần nhất, đồng thời đánh giá sự thay đổi về tỉ lệ của quần thể tế bào ở từng giai đoạn sau khi phân lập.