được phân lập
Sau 2 ngày nuôi cấy, môi trường được thay toàn bộ lần đầu tiên để loại bỏ tất cả các tế bào không bám dính. Có 2 loại tế bào bám dính xuống bề mặt đĩa nuôi cấy có thể quan sát thấy (Hình 12):
(i) Dạng thứ nhất là những tế bào nội mô sinh trưởng tạo thành lớp đơn. Chúng có kích thước lớn hơn tế bào trung mô, hình đa giác với 1 nhân hình ô van nằm ở trung tâm. Thường không phân biệt được ranh giới giữa các tế bào. Các tế bào nội mô mỏng và phẳng. Dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại lớn có thể nhìn thấy tế bào chất của tế bào nội mô có rất nhiều hạt (Hình 12– mũi tên đen). Theo Jaffe và cộng sự thì chúng là các túi tiết tế bào chất hay các thể hình ô van hoặc hình que [20].
(ii) Dạng còn lại là tế bào gốc trung mô có kích thước nhỏ hơn tế bào nội mô, hình dạng thuôn dài giống như các nguyên bào sợi trong nuôi cấy. Do xung quanh hạch nhân có chứa các nhiễm sắc chất được phân tán đều đặn nên có thể dễ dàng quan sát thấy nhân của tế bào trung mô to và tròn (Hình 12 – mũi tên trắng).
Hình 12. Tế bào 2 ngày nuôi cấy in vitro sau khi phân lập Mũi tên trắng: Tế bào dạng MSC hình thoi giống nguyên bào sợi;
Mũi tên đen: Tế bào dạng nội mô bám thành từng cụm có kích thước nhỏ, hình đa giác và dẹt. (Độ phóng đại 10x20)
Có thể quan sát thấy sau 2 ngày phân lập và nuôi cấy, quần thể tế bào dạng nguyên bào sợi được cho là MSC có tỉ lệ khá ít trong quần thể ban đầu khi mới phân lập. Để đánh giá tỉ lệ MSC có trong quần thể tế bào ban đầu khi mới được phân lập để thấy sự thay đổi sau thời gian nuôi cấy, chọn lọc MSC. Chúng tôi tiến hành phân tích
quần thể tế bào bằng phương pháp Flow cytometry sử dụng marker âm tính là CD34, marker dương tính là CD73 và CD90 (Hình 13).
Hình 13. Kết quả phân tích quần thể tế bào phân lập từ lớp lót tĩnh mạch bằng phương pháp dòng chảy tế bào
Các tế bào hầu như không có hiện tượng tự phát huỳnh quang ở các bước sóng sử dụng để phân tích (ĐC); Tỷ lệ tế bào dương tính với marker CD34 khá cao do tế bào nội mô chiếm đa số trong quần thể (CD34); Tỷ lệ tế bào dương tính với CD90 khá thấp (CD90); Tỷ lệ tế bào dương tính với CD73 tương đối cao (CD73).
Kết quả phân tích Flow Cytometry cho thấy rằng, ở lô đối chứng các tế bào không tạo nhiễu huỳnh quang khi không được xử lý gắn kháng thể và không tạo liên
kết không đặc hiệu khi ủ với kháng thể kháng IgG chuột (kết quả không thể hiện). Tỷ lệ tế bào dương tính với CD34 khá cao, chiếm 45,6%. Đây là một marker của các tế bào gốc dòng máu, tuy nhiên, tế bào nội mô mạch máu dây rốn khi mới phân lập được cũng biểu hiện marker [6, 31]. Điều này cho thấy sự hiện diện của tế bào nội mô trong quần thể tế bào sau khi phân lập là khá cao. Để định lượng chính xác tỷ lệ quần thể tế bào nội mô ở đây ta cần phải sử dụng thêm các marker dương tính với chúng. Tuy nhiên nghiên cứu này chúng tôi tập trung vào loại tế bào có tiềm năng ứng dụng cao hơn là tế bào gốc trung mô. Đối với các marker dương tính với tế bào gốc trung mô là CD73, CD90 thì tỷ lệ này chiếm lần lượt là (71%) và (15,1%). Trong khi tỷ lệ tế bào dương tính với với CD73 là khá cao thì đối với CD90 lại khá thấp. Như vậy là có một quần thể tế bào biểu hiện CD73 nhưng không biểu hiện CD90. Chính vì đặc điểm này mà khi xác định đặc tính của một dòng tế bào bất kỳ người ta luôn kết hợp nhiểu marker. Kết hợp cùng với kết quả phân tích biểu hiện đối với CD90, chúng tôi có thể khẳng định được MSC có thể chỉ chiếm một tỷ lệ rất thấp và quần thể tế bào ở giai đoạn này vẫn còn hỗn tạp nhiều loại tế bào khác nhau. Để nghiên cứu sự thay đổi tỷ lệ MSC trong quần thể chúng tôi tiến hành nuôi cấy chọn lọc và tiếp tục phân tích Flow cytometry.