L ỜI MỞ ĐẦU
2.2.2 Nguyên liệu và hoá chất
Bảng 2.1: Môi trường 1 (Thạch dinh dưỡng)
THÀNH PHẦN HÀM LƯỢNG (g) Khoai tây Cà rốt Giá đỗ Nước Đường Cao nấm men Pepton Agar pH 300 100 75 1(lít) 20 1 1 20 5.5 – 6
Bảng 2.2: Môi trường 2 (Thạch dinh dưỡng có bổ sung vitamin B1)
Bảng 2.3: Môi trường 3 (Thạch dinh dưỡng có bổsung dinh dưỡng)
THÀNH PHẦN HÀM LƯỢNG (g) Khoai tây Cà rốt Giá đỗ Nước Đường Cao nấm men Pepton Agar pH Vitamin B1 300 100 75 1(lít) 20 1 1 20 5.5 - 6 5(ml) THÀNH PHẦN HÀM LƯỢNG (g) Khoai tây Cà rốt Giá đỗ Nước Đường Cao nấm men Pepton Agar pH Dinh dưỡng 300 100 75 1(lít) 20 1 1 20 5.5 - 6 5(ml)
Pha chếmôi trường:
- Khoai tây, cà rốt và giá đỗ rửa sạch, để ráo nước.
- Khoai tây, cà rốt gọt bỏ vỏ, rửa sạch rồi cắt lát mỏng.
- Nấu chín khoai tây, cà rốt, giá với nước cất rồi lọc lấy nước đã nấu. (chú ý trong lúc nấu phải vớt sạch bọt)
- Thêm nước cất cho đủ1 lít môi trường.
- Bổ sung đường, agar, pepton và cao nấm men vào, tiếp tục nấu khoảng 5 – 10 phút cho tan agar.
- Đối với môi trường 2 thì bổ sung vitamin B1, còn môi trường 3 bổ sung dinh
dưỡng.
Chú ý: Trong khi nấu phải khuấy liên tục để cao nấm men tan đều và agar không lắng xuống đáy.
- Đem hấp tiệt trùng ở 1210C, 1.4atm. Để nguội 24 giờ, xem có bị nhiễm khuẩn không trước khi cấy giống vào.
2.2.2.2 Môi trường thócBảng 2.4: Môi trường thóc Bảng 2.4: Môi trường thóc THÀNH PHẦN HÀM LƯỢNG (%) Thóc CaCO3 Cám 89 1 10 Phương pháp:
- Hạt lúa được rửa sạch, loại bỏ hạt lép và ngâm qua đêm (12h), vớt ra để ráo
nước.
- Hạt lúa được đun sôi đến khi hé nứt rồi để nguội, trộn đều với bột đá và cám, rồi dồn vào chai thủy tinh, nút bông không thấm nước.
- Đem hấp tiệt trùng ở 1210C, 1.4atm. Để nguội 24 giờ, xem có bị nhiễm khuẩn không trước khi cấy giống vào.
2.2.2.3 Môi trường cọng mì
Chẻ thành cọng nhỏ (10-12cm)
Sơ đồ 2.1: Qui trình làm môi trường cọng mì Thân cây khoai mì(sắn)
Ngâm nước(1 ngày)
Ngâm vôi 0.5%, 48 giờ
Vớt ra – rửa sạch
Làm ráo nước
Trộn 5% cám
Cho cọng vào chai
Khử trùng (1210C, 1.4atm)
2.2.2.4 Môi trường mùn cưa bổ sung cám gạo
Nấm A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea và A. polytricha là hai loài nấm chủ
yếu mọc trên thân cây gỗ, nên chúng tôi tiến hành nuôi trồng trên cơ chất có thành phần chủ yếu là mạt cưa bổ sung đạm vô cơ và hữu cơ và một số chất dinh dưỡng khác theo công thức sau:
Bảng 2.5: Giá thể 1 (Bổsung 10% cám vào mùn cưa)
Bảng 2.6: Giá thể 2 (Bổsung 5% cám vào mùn cưa)
THÀNH PHẦN TỶ LỆ % (TRỌNG LƯỢNG ) Mạt cưa cao su Cám gạo Cám ngô CaCO3 Phân DAP Độẩm pH 89 6 4 0.7 0.3 65 -70 5.5 – 6 THÀNH PHẦN TỶ LỆ % ( TRỌNG LƯỢNG ) Mạt cưa cao su Cám gạo Cám ngô CaCO3 Phân DAP Độẩm pH 94 3 2 0.7 0.3 65 – 70 5.5 – 6
Tiêu chuẩn nguyên liệu:
- Không dùng mùn cưa đã bị mốc.
- Mùn cưa mới dùng ngay là tốt nhất. Nếu dùng dần phải phơi khô, tránh để
lên men hoặc bị ẩm, mốc gây mùn hóa làm mất chất dinh dưỡng.
Tạo ẩm, phối trộn nguyên liệu, đóng túi:
- Mùn cưa nên sàn (Hoặc rây) nhằm loại bỏ các dăm bào, gỗ vụn. Các dạng này hút ẩm chậm làm khi hấp khử trùng không đạt. Các dạng này còn là nguyên nhân làm thủng, rách bịch khi đống bịch.
- Tạo ẩm mùn cưa bằng nước sạch, ủ thành đống, che đậy bằng nilon để mùn
cưa ngấm đủnước và trương nở các tế bào gỗ.
- Sau vài ngày tiến hành phối trộn nguyên liệu theo tỷ lệ của bảng giá thể 1 và giá thể 2.
- Trộn thật đều nguyên liệu, kiểm tra độ ẩm đạt 65%, sau đó tiến hành đóng
túi.
Cách đóng túi mùn cưa:
- Mùn cưa được đóng trong túi nilon (Loại túi PP chịu nhiệt), kích thước túi: 19x37cm. Túi có hình dáng một khúc gỗ cao 20-22cm, có cổ nút, nút bông và nắp
đậy.
- Cho mùn cưa vào dần, vào đến đâu dồn chặt đến đấy (Chừa phía trên 5 –
7cm để luồn cổ bịch). Sau đó túm đầu nilon và cho luồn qua cổ bịch, bẻ quặt xuống
để cổ bịch nằm giữa hai lớp nilong. Dùng dây chun buộc chặt cổ bịch lấy bông không thấm nước vo tròn thành nút và nút chặt vào cổ bịch, đậy nắp lại.
Hấp khửtrùng túi mùn cưa:
- Thanh trùng bịch cơ chất theo phương pháp Tyndall (Khử trùng gián đoạn) trong nồi hơi ở 1000C trong 4 giờ, sau đó để nguội 24 giờ cho bào tử tạp nhiễm
- Để nguội cấy giống.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Tách và phân lập giống nguyên chủng bằng phương pháp nuôi cấy mô
- Chọn quả thể nấm to khỏe, không bị nhiễm mốc, nhiễm khuẩn đang ở thời kỳ
còn non.
- Rửa sạch vài lần bằng nước cất. - Gọt sạch phần chân nấm.
- Dùng cồn 70o lau sạch bề mặt nấm, đặt vào đĩa petri đã khử trùng đưa vào
buồng phân lập. Dùng dao lam hoặc dao mỏng sắc vô trùng cắt phần mô bên ngoài
ra để lộ phần mô bên trong. Khử trùng dao cắt trên ngọn đèn cồn để nguội cắt phần mô bên trong lộ ra thành từng miếng nhỏ và cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn.
2.3.2 Khảo sát tốc độ lan và đặc điểm của tơ nấm A. delicata (Fr.) Henn. f.
purpurea so với loài mộc nhĩ chuẩn A. polytricha
2.3.2.1 Khảo sát tốc độ lan và đặc điểm của tơ nấm A. delicata (Fr.) Henn. f.
purpurea so với loài mộc nhĩ chuẩn A. polytricha trên 3 loại môi trường thạch
Đểxác định môi trường thích hợp nhất cho việc bảo quản và nhân giống cấp 1, chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độtăng trưởng của hệ sợi nấm trên các loại môi
trường có thành phần theo công thức của bảng 2.1, bảng 2.2 và bảng 2.3.
Để khảo sát tốc độlan tơ nấm trên môi trường thạch chúng tôi tiến hành làm
như sau:
- Cấy các giống đã phân lập được từ ống nghiệm chứa giống thuần khiết sang các ống nghiệm khác chứa môi trường thạch đã chuẩn bị sẵn.
- Ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 22 – 320C, quá trình
ủ tiến hành trong phòng ủ tối hoặc có ánh sáng khuếch tán nhẹ.
- Theo dõi sựtăng trưởng và đo đường kính khuẩn lạc ở các thời điểm 3, 4, 5, 6, 7 ngày sau khi cấy giống. Tính toán tốc độ lan của hệ sợi theo các phương pháp
thống kê thông dụng (Trắc nghiệm Student, với P = 0.05). - Vẽ biểu đồ và so sánh kết quả hai loài.
2.3.2.2 Khảo sát tốc độ lan và đặc điểm của tơ nấm A. delicata (Fr.) Henn. f.
purpurea so với loài mộc nhĩ chuẩn A. polytricha trên môi trường thóc
Khảo sát tốc độ phát triển và khảnăng thích nghi trong điều kiện giá thể bổ sung cơ chất (10% cám). Đây là giai đoạn quan trọng trong qui trình sản xuất nấm.
Giai đoạn này hệ sợi chuyển từmôi trường thạch giàu dưỡng chất qua môi trường giá thể nghèo dưỡng chất làm tăng khảnăng thích nghi và phát triển của hệ sợi nấm. Từđó đánh giá khảnăng được dùng làm giống sản xuất của hệ sợi nấm A. delicata
(Fr.) Henn. f. purpurea.
Tiến hành: Cấy các giống từ trong môi trường thạch vào trong chai có môi
trường hạt. Nuôi ủtơ ở nhiệt độ phòng. Thu nhận kết quả từngày tơ nấm bung ra và bám vào hạt lúa cho đến khi sợi nấm ăn kín bề mặt chai lúa và bện chặt. Nhận xét
đặc điểm phát triển, đo kích thước vẽ biểu đồ và tiến hành so sánh loài chuẩn A. polytricha. Tính toán tốc độ lan của hệ sợi theo các phương pháp thống kê thông dụng (Trắc nghiệm Student, với P = 0.05).
2.3.2.3 Khảo sát tốc độlan và đặc điểm của tơ nấm A. delicata (Fr.) Henn. f.
purpurea so với loài mộc nhĩ chuẩn A. polytricha trên môi trường cọng mì
Chúng tôi không chọn môi trường cọng mì có bổ sung cám gạo làm thí nghiệm đo đạc, mà chỉ sử dụng đểlàm môi trường cấy chuyền vào bịch giá thể mùn
cưa đem đi nuôi trồng. Vì đây là môi trường trung gian và giữa các cọng mì có kẻ
hở, nên khi cấy chuyền chúng tôi không đo đạc được một cách chính xác về tốc độ lan tơ của hai loài.
2.3.3 Quá trình nuôi trồng thử nghiệm
Sau khi đã nhân giống thành công 2 đối tượng trên với số lượng khá nhiều, chúng tôi tiến hành nuôi trồng thử nghiệm trên môi trường cơ chất mùn cưa cây cao
2.3.3.1 Khảo sát tốc độlan và đặc điểm của tơ nấm A. delicata (Fr.) Henn. f.
purpurea so với loài mộc nhĩ chuẩn A. polytricha trên môi trường mùn cưa cao
su
Nhằm tìm hiểu khả năng có thể dùng làm giống trong sản xuất đại trà của nấm A. delicata. Chúng tôi dùng giống trên môi trường thóc và môi trường cọng để
cấy vào bịch giá thể 1 và giá thể 2. Chuyển các bịch đã cấy vào buồng ủ có nhiệt độ
22 -320C, độ ẩm 80 – 90%. Khi hệ sợi bắt đầu bện kết để hình thành mầm quả thể chúng được đưa lên phòng nuôi có nhiệt độ 28 -320C, độ ẩm 85 – 95%, ánh sáng khuếch tán nhẹ. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi được cấy từ môi
trường thóc và môi trường cọng vào giá thể 1 và giá thể 2, tính toán tốc độlan tơ, vẽ
biểu đồ và tiến hành so sánh. Tất cả số liệu thực nghiệm được tính toán theo các
phương pháp thống kê thông dụng (Trắc nghiệm Student, với P = 0.05).
Đểđánh giá quá trình hình thành, sinh trưởng, phát triển của nấm mộc nhĩ A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea trên giá thể tổng hợp chúng tôi đã tiến hành nuôi trồng tưới đón quá trình phát sinh thể quả, thu hái và mô tả hình thái bên ngoài. Các kĩ thuật trồng nấm mộc nhĩ sử dụng trong đề tài này là các kỹ thuật đang được áp dụng ở phòng thí nghiệm nấm Cát Tiên.
2.3.3.2 Phân tích thành phần dinh dưỡng
Gởi mẫu cho Viện Công nghệ Hóa Học TPHCM phân tích.
2.3.3.3 Đề xuất qui trình nuôi trồng nấm A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đặc điểm hình thái của mộc nhĩ A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea
3.1.1 Hình thái quả thể của A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea
Mẫu nấm A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea thu thập được có những đặc
điểm cơ bản thống nhất với những mô tả chính xác của Lowy và Kobayasi:
- Thể quả chắc, hình tròn, chất keo nhầy như cao su khi tươi, không có cuống hoặc cuống rất ngắn, rộng tới 8 cm.
Hình 3.1: Nấm mộc nhĩ A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea thu thập được tại Nam Cát Tiên
- Đặc điểm hai mặt của tai nấm trưởng thành:
+ Mặt bất thụ (Mặt mũ) hầu như nhẵn, được phủ một lớp lông mịn có màu
nâu đỏ, nâu tím pha lẫn màu xám đen, có các đường rạn nứt màu xám trắng, không có gân trung tâm.
+ Mặt hữu thụ (Bề mặt bào tầng) có màu hồng tím, có nhiều đường gân dày
đặc tạo thành dạng lưới với lỗ rộng, đa giác với những gờ nối và nhiều bào tử lấm tấm trắng.
3.1.2 Cấu trúc hiển vi
Zona pilosa: lông cứng biến động mạnh, dài 60 – 175µm, đỉnh hơi nhọn hoặc tù – tròn.
Zona compacta: dày 20 – 30µm, hệ sợi đan cài dày đặc, không phân biệt rõ từng sợi.
Zona subcompacta superioris: dày 40 – 50µm, sợi mảnh, phân bốẩn nhập.
Zona intermedia: dày 400 – 500µm, có khoảng không rộng, trong suốt.
Zona subcompacta inferioris: dày 135 – 145µm, sợi nhỏ, mảnh, đan cài dày đặc.
Hymenium: dày 80 – 90µm, đảm đa bào (4 tế bào) dài 40 – 50µm, bào tử đảm dạng hạt đậu có 2 – 3 giọt dầu nổi sáng.
Hình 3.2: Bụi bào tử màu trắng kem
Hình 3.4: Cấu trúc cắt dọc quả thể A. delicata
Hình 3.5: Zona pilosa trên cấu trúc cắt dọc quả thể A. delicata
Zona pilosa Zona compacta
Hymenium Zona intermedia
3.2 Tách và phân lập giống nguyên chủng bằng phương pháp nuôi cấy mô
Sau khi cấy xong đưa vào tủ ấm ở 30oC. Sau một ngày mô thịt sẽ xuất hiện sợi nấm và lan dần trên môi trường thạch. Sau khi phân lập chúng tôi cấy chuyền và nhân giống lên với sốlượng cần thiết. Giống lưu giữ bảo quản trong tủ lạnh 6-8oC.
Hình 3.6: Ống giống 7 ngày tuổi 3.3 Đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi trên môi trường thạch
Trên môi trường nuôi cấy thuần khiết, hệ sợi nấm mộc nhĩ A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea phát triển dưới dạng hình rễ khá sớm, lúc còn non sợi có màu trắng đục, sau 10 ngày vùng sợi già chuyển sang màu vàng nâu. Trong quá trình
sinh trưởng và phát triển, nấm tiết ra trên bề mặt thạch dịch không màu, chất này không gây ảnh hưởng xấu đến sựsinh trưởng và phát triển của hệ sợi.
Trong quá trình thí nghiệm chúng tôi nhận thấy ở thời điểm 10 – 15 ngày hệ
sợi nấm bắt đầu tiết sắc tố vàng nâu, lúc này sợi nấm đã già. Nếu sử dụng giống già
để cấy lên chai giá thể thì sẽcho năng suất thấp. Vì vậy, chúng tôi thường cấy giống
trước độ tuổi 10 ngày. Tuy nhiên để khẳng định đâu là môi trường phù hợp nhất cho sợi nấm tăng trưởng, đâu là thời điểm sợi nấm sinh trưởng tốt nhất và thích hợp nhất
để cấy vào giá thể hoặc cấy chuyền giữ giống, chúng tôi cấy giống vào các đĩa
320C. Sau đó chúng tôi theo dõi tốc độ tăng trưởng khuẩn lạc của loài A. delicaca
(Fr.) Henn. f. purpurea trong 3, 5, 7, 9 ngày và có so với loài chuẩn A. polytricha, xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê Student (P=0.05). Kết quả được dẫn ra bảng sau:
Bảng 3.1: Tăng trưởng của hệ sợi nấm mộc nhĩ trên môi trường 1
Biểu đồ 3.1: So sánh tốc độtăng trưởng của hệ sợi loài A. delicata và A.
polytricha trên môi trường 1
Thời gian (ngày)
Chiều dài của sợi nấm (cm)
A. delicata A. polytricha 3 5 7 8 9 1.63 ± 0.173 4.30 ± 0.226 7.60 ± 0.113
Tơ lan đầy đĩa Tơ lan đầy đĩa
1.20 ± 0.113
4.00 ± 0.113
6.60 ± 0.113
7.60 ± 0.113
Bảng 3.2: Tăng trưởng của hệ sợi nấm mộc nhĩ trên môi trường 2
Biểu đồ 3.2: So sánh tốc độtăng trưởng của hệ sợi loài A. delicata và A.
polytricha trên môi trường 2
Thời gian (ngày)
Chiều dài của sợi nấm (cm)
A. delicata A. polytricha 3 5 7 9 11 13 15 0.67 ± 0.065 1.53 ± 0.173 2.50 ± 0.196 3.83 ± 0. 173 5.43 ± 0.065 6.83 ± 0.173 Tơ ngừng phát triển 0.63 ± 0.131 1.37 ± 0.131 2.07 ± 0.131 3.53 ± 0.261 5.27 ± 0.236 6.87 ± 0.397 Tơ ngừng phát triển
Bảng 3.3: Tăng trưởng của hệ sợi nấm mộc nhĩ trên môi trường 3
Biểu đồ 3.3: So sánh tốc độtăng trưởng của hệ sợi loài A. delicata và A.
polytricha trên môi trường 3
Thời gian (ngày)
Chiều dài của sợi nấm (cm)
A. delicata A. polytricha 3 5 7 8 2.10 ± 0.113 5.03 ± 0.065 7.93 ± 0.173
Tơ lan đầy đĩa
2.40 ± 0.113
5.50 ± 0.226
8.13 ± 0.065
NHẬN XÉT:
Trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau tốc độ tăng trưởng của hệ sợi mộc nhĩ khác nhau:
- A. delicata (Fr.) Henn. f. purpurea có tốc độ phát triển nhanh. Giữa 3 môi
trường có sự khác biệt khá rõ rệt về tốc độ lan của hệ sợi trên bề mặt thạch. Ở môi
trường 1: từ lúc cấy giống đến thời điểm 7 ngày sợi tăng trưởng nhanh, từ 7 – 9 ngày sợi tăng trưởng chậm lại và đặc biệt trong khoảng thời gian 3 – 5 ngày sợi tăng trưởng mạnh đạt tốc độ cực đại (Có thể tăng 1.5 cm/ngày) nhưng sau 10 ngày sợi nấm có hiện tượng già. Ở môi trường 2: từ lúc cấy giống đến thời điểm 9 ngày sợi
tăng trưởng chậm, sợi mảnh và non yếu, từ 9 – 11 ngày sợi tăng trưởng mạnh đạt tốc độ cực đại (Có thểtăng 1 cm/ngày) nhưng từ 13 – 15 ngày tơ ngừng tăng trưởng