Mẫu độc tố thô C. striatus được pha loãng trong nước muối sinh lý và thử độc tính trên chuột bằng cách tiêm ở ổ bụng. Kết quả thử chuột được trình bày ở bảng 3.10 và hình 3.17, 3.18.
Bảng 3.10: Kết quả thử độc tính của loài Conus striatus trên chuột theo dõi 24h
Mẫu độc tố C. striatus thô cho kết quả dương tính trên chuột với liều thử thách từ 0.5mg đến 2mg chuột có biểu hiện của triệu chứng ngộ độc.
Hình 3.17: Thử nghiệm độc tố Conus striatus trên chuột . a: chuột chưa tiêm độc tố, b: tiêm độc tố vào ổ bụng, c: chuột tử vong sau khi tiêm độc tố.
Chuột Liều
(mg)
Biểu hiện
Chuột 1 0.5 Chuột có biểu hiện mệt mỏi, rối loạn vận động sau
Chuột 2 1 Chuột có biểu hiện mệt mỏi, rối loạn vận động sau
Chuột 3 2 Chuột biểu hiện của triệu chứng suy hô hấp, hơi thở
nhanh dần, rối loạn vận động, bước đi chậm dần, bị liệt
toàn thân sau đó dần dần dẫn tới hôn mê và tử vong
Hình 3.18: Chuột tử vong sau khi tiêm độc tố Conus striatus thô vào ổ bụng 3.5.2. Chuẩn bị mẫu quét phổ UV-Vis và tinh sạch protein
Lấy 290mg mẫu pha loãng trong 2ml dung dịch nước muối sinh lý. Với độ pha
loãng 1/80, mẫu được đo bước sóng liên tục từ 190nm – 1000nm. Mẫu thô sau khi đo cho thấy có 2 peak được trình bày ở hình 3.19 .
Hình 3.19: Mẫu thô hai peak hấp thụ ở bước sóng OD215nm = 3.561 và OD265nm = 2.941
3.5.3. Chạy sắc ký lọc gel
Tiến hành đo OD280nm các tube thu được, kết quả cho thấy 7 peak được trình
Hình 3.20: Kết quả chạy sắc ký lọc gel của Conus striatus (Biểu đồ thu ngắn)
Hình 3.21: Kết quả chạy sắc ký lọc gel của Conus striatus (Biểu đồ hoàn chỉnh) 3.5.4. Phân tích bằng HPLC
Tiến hành đông khô các mẫu độc tố thu được qua sắc ký lọc gel (7 tube kí hiệu
striatus 1-7) sau đó phân tích các mẫu này trên HPLC/UV- Vis tại bước sóng 254nm, tốc độ dòng 0,5ml/phút.
Qua tiến hành khảo sát chương trình chạy gradient tại thời gian 75 phút chúng tôi
thu được các sắc đồ được biểu diễn ở hình 3.23. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến
hành chạy sắc ký đối với mẫu độc tố thô chưa phân tách (hình 3.22)
Qua các sắc ký đồ chúng tôi nhận thấy mẫu độc tố ở 7 tube đều có các peak xuất hiện rõ và khác cao tại các khoảng thời gian lưu 3-8 phút (5 peak ở các tube 2-6 và 6 peak ở tube 7), riêng tube 1 chứa nhiều tạp chất nên các peak thể hiện không rõ ràng. Các tube 3,5,7 có thêm 2 peak ở khoảng thời gian lưu 48 và 63 phút, cụ thể như sau: 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 T ube O D 2 8 0 0 5 10 15 20 1 13 25 37 49 61 73 85 97 109 121 133 Tube O D 2 8 0
Tube 1: thu được 3 peak khá rõ với độ hấp thu khoảng 20-30 mAbs trong
khoảng thời gian từ phút 41-46 và một chùm các peak khá nhỏ trong khoảng
thời gian từ phút 37-40.
Tube 2: thu được 2 nhóm peak từ phút thứ 3 - phút thứ 6 với 4 peak và chiều cao các peak khá lớn, đặc biệt là peak thứ 4 tại thời gian lưu ở phút thứ 6 với
độ cao của peak đến 700 mAbs. Một nhóm peak từ phút 35-47 với chiều cao
rất thấp khoảng 10 mAbs, đây có thể là các peak tạp.
Tube 3: thu được 2 nhóm peak từ phút thứ 3 - phút 7 với 6 peak và chiều cao các peak khá lớn, đặc biệt là peak thứ 5 tại thời gian lưu ở phút thứ 6 với độ cao của peak đến 600 mAbs. Một nhóm gồm 2 peak ở phút 48 và phút 63 với
chiều cao rất thấp khoảng 20 mAbs, 2 peak này tách rõ ràng.
Tube 4: thu được 1 nhóm peak từ phút thứ 3,5 - phút thứ 5 với 5 peak và chiều cao các peak khá lớn, đặc biệt là peak thứ 2, 3 và 5 tại thời gian lưu ở phút thứ 4; 4,7 và 5,3 với độ cao của peak đến khoảng 500 mAbs.
Tube 5: thu 8 peak trong đó từ phút thứ 3 - phút thứ 7 với 6 peak và chiều cao các peak khá lớn đặc biệt là peak thứ 2 và thứ 5 tại thời gian lưu ở phút
thứ 4 và thứ 6 với độ cao các peak lần lượt là 250 mAbs và 650 mAbs. Một
nhóm gồm 2 peak ở phút 13 và phút 65 với chiều cao rất thấp khoảng 20 mAbs, 2 peak này tách rõ ràng, peak có thời gian lưu ở phút 13 có hình dáng chùm và bề rộng peak lớn.
Tube 6: thu 8 peak trong đó từ phút thứ 2 - phút thứ 16 với 8 peak và chiều cao các peak khá lớn, đặc biệt là peak thứ 3 và thứ 7 tại thời gian lưu ở phút thứ 3, 3 và 6 với độ cao của peak lần lượt là 550 mAbs và 700 mAbs.
Tube 7: thu 9 peak trong đó từ phút thứ 2 - phút thứ 7 với 7 peak và chiều cao các peak khá lớn đặc biệt là peak thứ 4 và thứ 7 tại thời gian lưu ở phút thứ 4 và thứ 6,5 với độ cao của peak lần lượt là 450 mAbs và 600 mAbs. Một nhóm gồm 2 peak ở phút 48 và phút 63 với chiều cao rất thấp khoảng 20 mAbs, 2 peak này tách rõ ràng.
Hình 3.22: Phổ sắc ký đồ của Conus striatus thô chưa tách chiết protein ở gradient 120 phút
Hình 3.23: Phổ sắc ký đồ độc tố Conus striatus đã tách chiết protein tube 4, 6 và 7 (sắc đồ hoàn chỉnh và sắc đồ tại vị trí thời gian lưu 3-7 phút)
Thảo luận:
Cruz và cs (1985) tinh sạch các µ-conotoxin (GIIIA, GIIIB, GIIIC) từ tuyến nọc độc của loài ốc ăn cá Conus geographus kết quả chạy sắc ký lọc gel độc tố thô phát hiện 4 peak, các µ-conotoxin được phát hiện ở peak thứ 2, phổ sắc ký đồ chạy HPLC của µ-conotoxin cho thấy khá nhiều peak trong đó GIIIA, GIIIB, GIIIC phát hiện ở khoảng thời gian lưu từ 12-16 phút.
Cruz và cs (1992) tách chiết, tinh sạch và giải trình tự peptide độc tố từ tuyến nọc độc của Conus textile, kết quả thử độc tính đã được chứng minh có hiệu quả ở
chuột, nọc độc của Conus textile cũng tác động đến hệ thống thần kinh trung ương
gây ra các triệu chứng giống như động kinh và dẫn đến tử vong. Phổ sắc ký đồ sau khi phân tích HPLC thu được các peak ở khoảng thời gian lưu 10-20 phút, 40-50 phút và 60-70 phút.
Jimenez và cs (1996) cũng đã xác định peptide chứa hàm lượng tryptophan cao (contryphan) được tinh sạch từ tuyến nọc độc của loài ốc ăn cá Conus radiatus. Kết quả thử độc tính trên chuột ở loài này cho thấy ở liều thấp (0.5-2.5 nmol/g) chuột có biểu hiện liếm và cắn bàn chân, thỉnh thoảng đưa đuôi lên, thỉnh thoảng vận động thái quá. Liều trung bình (4-6 nmol/g) có biểu hiện nâng cao đuôi gần như vuông góc với cơ thể, có động tác lộn nhào sau đó trở nên thụ động. Liều cao (8-20nm/g) chuột chuyển động vòng tròn, có động tác lộn nhào, liệt tứ chi và chết. Phổ sắc ký
đồ cũng cho thấy số lượng lớn các peak ở khoảng thời gian lưu từ 40-80 phút.
Jimenez và Olivera (2010) ghi nhận 6 peptide mới từ loài ốc ăn cá Conus parius
thuộc superfamily M (pr3a và pr3b) và O (pr6a, pr6b, pr6c, pr6d). Trong đó, các peptide pr3a, pr3b, pr6a, pr6b được chứng minh là có hoạt tính sinh học khi thử nghiệm độc tính trên cá cụ thể: peptide pr3a (1nmol) gây tê liệt sau 5 phút trong khi pr3b làm suy yếu và khó khăn trong việc bơi sau 20 phút, peptide pr6a (1nmol) gây
rối loạn hoạt động và bơi theo các hướng khác nhau sau 14 phút trong khi pr6b (0.5
nmol) đã dẫn đến tê liệt sau 6 phút. Phổ sắc ký đồ của các peptide cho thấy pr3a được xác định ở khoảng thời gian lưu từ 60-80 phút, pr3b trong khoảng thời gian
lưu 40-60 phút, pr6a từ 100-120 phút, pr6b, pr6c và pr6d cũng ở khoảng thời gian 40-60 phút.
Hầu hết các nghiên cứu này đều tập trung vào việc giải trình tự các peptide độc
tố thu được cũng như xác định cấu trúc các peptide bằng phương pháp sắc ký khối
phổ (HPLC-MS) nên có thể xác định các họ và chức năng của các peptide này.
Kết quả chạy sắc ký HPLC cho thấy mẫu độc tố ở 7 tube (striatus 1-7) đều có các peak (5-7 peak) xuất hiện rõ và khá cao tại các khoảng thời gian lưu 3 phút đến 8 phút , riêng tube 1 chứa nhiều tạp chất nên các peak thể hiện không rõ ràng . Các tube 3, 5, 7 có thêm 2 peak ở khoảng thời gian lưu 48 và 63 phút. Sau khi tinh chế
và phân đoạn, loại bỏ tube 1 bị tạp nhiễm, các phân đoạn còn lại cho tổng số peak
lên đến 45. So sánh với các nghiên cứu trước các sắc đồ của nghiên cứu hiện tại cũng cho kết quả tương tự về phổ sắc ký và thời gian lưu.
Vì không có đủ thời gian và điều kiện nên nghiên cứu của chúng tôi mới chỉ dừng lại ở bước đầu tách chiết và tinh chế độc tố thô. Vì vậy, cần có những nghiên cứu chuyên sâu để tìm hiểu về cấu trúc, chức năng, trình tự cũng như cơ chế hoạt động của các peptide thu được.
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đưa ra một số kết luận:
Giải phẫu tách tuyến độc của ba loài ốc cối đại diện cho ba phương thức dinh dưỡng khác nhau Conus striatus (ăn cá) , Conus textile (ăn nhuyễn thể)
và Conus vexillum (ăn giun biển). Tuyến độc của ba loài đều có các bộ phận: túi độc, ống dẫn độc, vòi hút và túi răng kitin.
Conus striatus có tuyến độc, túi độc và túi răng kitin lớn nhất trong ba loài, răng kitin dài, cứng và chắc nhất trong ba loài, có ba ngạnh trong đó ngạnh thứ ba có đầu gai uốn cong, không có dải răng cưa và eo răng.
Conus textile có chiều dài tuyến độc và ống dẫn độc lớn nhất tiếp đến là Conus vexillum và Conus striatus, răng kitin dài nhưng mảnh và yếu, có hai ngạnh.
Conus vexillum có khối lượng tuyến độc nhỏ và túi răng kitin ngắn nhất tương ứng với răng kitin nhỏ nhất trong ba loài, răng kitin chỉ có một ngạnh, một lưỡi và có eo răng.
Khảo sát mối quan hệ giữa các thông số hình thái và các bộ phận tuyến độc
của ba loài cho thấy cả ba loài đều có mối tương quan giữa khối lượng tuyến
độc và túi độc. Trong đó, Conus vexillum thể hiện mối tương quan lớn nhất
giữa các thông số khảo sát, đặc biệt là giữa khối lượng thân và khối lượng tuyến độc, túi độc. Ở hai loài Conus textile và Conus vexillum còn cho thấy mối quan hệ giữa chiều dài tuyến độc và chiều dài ống dẫn độc trong khi
Conus striatus hầu như không có mối tương quan nào giữa các thông số chiều dài.
Tách chiết được độc tố thô của ba loài ốc cối và thử nghiệm độc tính trên chuột ở loài có độc tính cao Conus striatus . Kết quả cho thấy mẫu độc tố C. striatus thô cho kết quả dương tính trên chuột với liều thử thách từ 0.5mg đến 2mg chuột có biểu hiện của triệu chứng ngộ độc.
Tinh sạch và xác định các phân đoạn peptide độc tố của loài C. striatus bằng
sắc ký lọc gel và HPLC. Kết quả chạy sắc ký lọc gel thu được 7 phân đoạn
peptide và các phân đoạn này đều cho các peak khá rõ khi phân tích HPLC
và tổng số peak thu được sau khi tinh sạch lên đến 45 peak.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu này chỉ dừng lại ở bước tách chiết và tinh chế độc tố thô, cần có
những nghiên cứu chuyên sâu để xác định cấu trúc và chức năng cũng như
trình tự của các độc tố thu được. Đây là hướng đang được các nhà khoa học quan tâm vì những ứng dụng to lớn của các peptide độc tố trong dược phẩm và sinh học thần kinh.
Tiếp tục mở rộng hướng nghiên cứu chuyên sâu về độc tố như tách chiết RNA độc tố ốc cối và giải trình tự gen độc tố, xác định cấu trúc, chức năng và trình tự các peptide độc tố.
Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc răng kitin của các loài ốc cối vì đây là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong định danh và phân loại các loài ốc cối bên cạnh hình thái, màu sắc và vân trên vỏ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bandyopadhyay P.K, Stevenson B.J, John-Paul Ownby, Matthew T. Cady, Maren Watkins, and Baldomero M. Olivera (2008). The
Mitochondrial Genome of Conus textile, coxI-coxII Intergenic. Sequences and Conoidean Evolution. Mol. Phylogenet. Evol. 46 (1): 215-223.
2. Barbier J, Lam Thanh H, F. Le Gall , Favreau P and Benoit E et al (2004). A delta-conotoxin from Conus ermineus venom inhibits inactivation in vertebrate neuronal Na+ channels but not in skeletal and cardiac muscles. J. Biol. Chem. 279: 4680- 4685.
3. Becker S and Terlau H (2008): Toxins from cone snail : properties,
applications and biotechnological production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79: 1-9.
4. Bergh R (1895). Beiträge zur Kenntniss der Coniden. Nova Acta Leopold. 65 (2): 69-214.
5. Bingham J.P, Mitsunaga E, Bergeron Z.L (2010). Drugs from slugs-Past, present and future perspectives of ω-conotoxin research, Chemico-Biological Interactions 183: 1-18
6. Bingham J.P, Jones A, Alewood P.F, Andrews P.R, Lewis R.J
(1996) Conus venom peptides (conopeptides): inter-species, intra- species and within individual variation revealed by ionspray mass spectrometry. Biochemical Aspects of Marine Pharmacology, Alaken Inc, Fort Collins, Colorado, USA. 13-27.
7. Bulaj G et al (2005). Novel conotoxins from Conus striatus and
Conus kinoshitai selectively block TTX-resistant sodium channels. Biochemistry 44 (19): 7259-65
8. Chivian E, Roberts C.M and Bernstein A.S (2003). The Threat to
9. Craig A.G, Norberg T, Griffin D, Hoeger C, Akhtar M, Schimidt K, Low W, Dykert J, Richelson E, Navarro V, Mazella J, Watkins M, Hillyard D, Imperial J, Cruz L.J and Olivera B.M
(1999). Contulakin, an O-glycosylated Conus peptide. J. Biol. Chem. 274: 13752-13759
10. Cruz A.Z, María Maillo, Estuardo López-Vera, Andrés Falcón, Edgar P. Heimer de la Cotera, Olivera B.M, Aguilar M.B (2006).
Amino acid sequence and biological activity of a γ-conotoxin-like peptide from the worm-hunting snail Conus austini. Peptides 27: 506- 511.
11. Cruz L.J, De Santos V, Zafaralla G.C, Ramilo C.A, Zeikus R, Gray W.R and Olivera B.M (1987). Invertebrate vasopressin/oxytocin homologs. Characterization of peptides from
Conus geographus and Conus striatus venoms. J. Biol. Chem. 262: 15821-15824.
12. Cruz L.J, Johnson D.S and Olivera B.M (1987). A
characterization of the omega-conotoxin target evidence for tissue- specific heterogeneity in Ca+ channel types Biochemistry 26: 820- 824.
13. Cunha R.L, Castilho R, Ruber L, Zardoya R (2005). Patterns of
Cladogenesis in the Venomous Marine Gastropod Genus Conus from
the Cape Verde Islands. Systematic Biology. 54: 634-650
14. Cunha R.L, Tenorio M.J, Carlos Afonso, Rita Castilho and Rafael Zardoya (2008). Replaying the tape: recurring biogeographical patterns in Cape Verde Conus after 12 million years. Molecular Ecology 17: 885-901.
15. Duda T.F and Rolan E (2005). Explosive radiation of Cape Verde
16. Duda T.F J.R, Kohn A.J and Matheny A.M (2009). Cryptic Species Differentiated in Conus ebraeus, a Widespread Tropical Marine Gastropod. Biol. Bull.217: 292-305.
17. Duda T.F J.R, Kohn A.J and Palumbi S.R (2001). Origins of diverse feeding ecologies within Conus, a genus of venomous marine gastropods. Biological Journal of the Linnean Society 73: 391- 409.
18. Duda T.F J.R, Kohn A.J (2005): Species-level phylogeography
and evolutionary history of the hyperdiverse marine gastropod genus
Conus. Mol. Phylogenet. Evol. 34: 257-272.
19. Duda T.F J.R and Palumbi S.R (1999). Molecular genetics of ecological diversification: duplication and rapid evolution of toxin genes of the venomous gastropod Conus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6820-6823.
20. Espiritu D J.D, Watkins M, Dia-Monje V, Cartier E, Cruz L.J and Olivera B.M (2001). Venomous cone snails: molecular
phylogeny and the generation of toxin diversity. Toxicon 39: 1899- 1916
21. Fan C.X, Chen X.K, Zhang C, Wang L.X, Duan K.L, He L.L, Cao Y, Liu S.Y, Zhong M.N, Ulens C, Tytgat J, Chen J.S, Chi C.W, and Zhou Z (2003). A novel conotoxin from Conus betulinus, κ-BtX, unique in cysteine pattern and in function is a specific BK channel modulator. J. Biol. Chem.278 (15): 12624-33.