Sắc ký là phương pháp phân tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp, bao
gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong pha động di chuyển qua pha tĩnh.
Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu.
Hiện nay, phương pháp sắc ký đang đóng vai trò quan trọng trong công nghệ sinh
học và dược phẩm. Nó được dùng để định danh, xác định tính chất và tinh chế các
phân tử ở tất cả các công đoạn của một quá trình từ nghiên cứu đến phát triển đáp
ứng yêu cầu đảm bảo chất lượng và kiểm định. Một số phương pháp sắc ký được
ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu : sắc ký lọc gel (dựa vào kích thước phân tử), sắc ký trao đổi ion (dựa vào điện tích của phân tử), sắc ký ái lực (dựa vào ái lực của phân tử với một phân tử khác) và sắc ký lỏng cao áp (dựa vào kích thước phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ áp suất).
2.2.4.2.2. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel
Nguyên tắc
Là quá trình phân tách các chất dựa trên kích thước phân tử. Mẫu được nạp vào
đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate
Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn
những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có
thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh
hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào
được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng.
Mỗi phân đoạn sắc ký sẽ có thời gian hồi lưu khác nhau để thu được từng loại protein cần quan tâm. Các phân đoạn protein được quan tâm cao nhất sẽ được tích lũy và tiến hành tinh sạch bổ sung. Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽ tăng lên khi các phân đoạn protein được chạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau. Thông thường
một cột sắc ký đơn lẻ không đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong
muốn nào đó dù quá trình sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó người ta
thường phải áp dụng một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được một phân đoạn
chứa một lượng lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu.
Tiến hành sắc ký
Vật liệu
- Cột sắc ký: d =2.5 cm, h =100 cm – Amersham.
- Bộ thu mẫu Collector Fraction 920 - Amersham
- Pump - LKB
- Gel Biogel P2 – Amersham - Acid acetic – Merck.
- Tube 15 – Nunc.
Tiến hành trên cột Biogel
Chuẩn bị cột Biogel (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nhồi cột: Cân 40g gel Biogel-P2 cho vào 200ml nước cất khuấy đều
trong 4h. Cho từ từ dung dịch chứa gel vào cột để lắng tự nhiên đến khi lượng gel đầy cột.
+ Cân bằng cột: Dùng dung môi acid acetic 1% cân bằng cột với thể tích bằng 5 lần thể tích cột, tốc độ dòng chảy 1,0ml/phút.
Tinh chế
+ Nạp mẫu: Cho từ từ 2 ml mẫu vào cột chờ cho mẫu thấm hoàn toàn
vào gel. Cho thêm 1ml acid acetic vào cột để đưa mẫu vào hoàn toàn trong gel.
+ Thôi mẫu: Chạy mẫu bằng dung dịch acid acetic 1%, dòng chảy 1 ml/phút, thu mẫu qua collector vào 120 tubes, mỗi tube 2ml.
+ Đo OD280 nm từ tube 1 đến tube 120 để xác định peak tinh chế.